Методика бактериологического исследования . Выделение возбудителя из крови (гемокультура) является ранним методом диагностики заболеваний. Бактериемия у больных тифо-паратифозным заболеванием появляется в конце инкубационного периода и не исчезает в течение всего лихорадочного периода болезни и во время рецидивов. Результаты бактериологического исследования в определенной степени зависят от сроков взятия материала и от количества засеваемой крови. Чем раньше от начала болезни произведен посев крови, тем больше вероятность обнаружения возбудителя. На первой неделе брюшного тифа кровь у больного берут из локтевой вены в количество 10 мл, в более поздние сроки и во время рецидивов - 20 мл.
В первый день исследования кровь засевают в соотношении 1:10 в одну из жидких сред. Указанное соотношение необходимо точно соблюдать, так как при меньшем разведении крови микробы могут погибнуть из-за бактерицидного ее действия. Для посева пользуются: 10% или 20% раствором желчного бульона, разлитого по 50-100 мл во флаконы, мясо-пептонным бульоном с добавлением 1 % глюкозы, стерильной дистиллированной водой - по методу Н. Н. Клодницкого, в которой происходит лизис эритроцитов, продукты их распада при этом служат хорошей питательной средой для размножения бактерий. Можно также использовать стерильную водопроводную воду. Лучшие результаты получаются при посевах материала на желчный бульон. Если невозможно произвести посев крови на месте, сыворотку вместе со сгустком или цитратную кровь (10 мл крови выливают в пробирку с 2 мл 5% стерильного натрия цитрата) направляют в лабораторию. Сгусток крови в лаборатории измельчают и засевают в одну из перечисленных сред. Флаконы помещают в термостат при температуре 37° С.
Второй день исследования . Через 14-24 ч от начала исследования производят посев материала в чашку Петри на среду Эндо или среду с эозином и метиленовым синим (среда Левина). Не рекомендуют использовать для посева среду Плоскирева, так как тифо-паратифозные палочки, находящиеся в крови, являются по типу питания облигатными паратрофами и не сразу меняют этот тип питания на метатрофный (то есть мертвыми органическими субстратами). Поэтому на этой среде, содержащей соли желчных кислот, палочки брюшного тифа растут очень плохо либо совсем не растут. При отсутствии роста бактерий после первого посева производят последующие через 48, 72 ч и на 5-е и 10-е сутки. Если при этом возбудитель выделить не удалось, выдается отрицательный ответ. В сомнительных случаях рекомендуют периодически - 1 раз в 3-4 дня - производить посевы до 24-го дня с момента взятия материала. Отрицательный ответ выдается все же на 7-й день.
Третий день исследования . Выросшие на средах Эндо и Левина «подозрительные» колонии (на среде Эндо колонии патогенных микробов бесцветны) идентифицируют, для чего 2-3 колонии пересевают на скошенный агар и среду Ресселя.
Четвертый день исследования . Учитывают и регистрируют результаты посева на среде Ресселя, изучают морфологические свойства выделенных культур в мазке, окрашенном по Граму. Определяют подвижность - наличие или отсутствие жгутиков - в висячей или раздавленной капле, взятой из 4-6-часовой бульонной культуры. Для этого агаровую культуру (одну петлю) засевают в 1 мл слегка подогретого бульона. Пересевают отобранные культуры (2-3 пробирки) на среды Гисса с маннитом, сахарозой и косой агар, а также в 2 пробирки с мясо-пептонным бульоном, в которые под пробки помещают полоски фильтровальной бумаги, смоченные специальными растворами для определения сероводорода и индола (развернутый «пестрый ряд»).
Пятый день исследования . Регистрируют изменения на развернутом «пестром ряду». При наличии газообразования ставят реакцию агглютинации со смесью сальмонеллезных сывороток. При положительной реакции проводят реакцию агглютинации с О- и Н-сыворотками и выдают окончательный ответ на основании совокупности всех признаков.
Выделение миелокультуры осуществляют путем посева полученного пунктата костного мозга в 3-5 мл бычьей стерильной желчи или в 25-30 мл 10% желчного бульона, ставят его в термостат и на следующий день производят пересев на среды Эндо или Вильсона - Блера. В дальнейшем этапы исследований те же.
Выделение бактерий из кала. С 8- 10-го дня болезни, чаще с третьей недели, у больных брюшным тифом, паратифами выделяются с испражнениями бактерии. Для исследования берут последние порции кала жидкой консистенции, эмульгируют в изотоническом растворе натрия хлорида (в соотношении 1:10) и оставляют на 30 мин до оседания крупных частиц. Для посева каплю материала берут с поверхности жидкости.
В первый день исследования материал засевают на среды обогащения - желчный бульон, среды магниевую, Мюллера, Кауфмана - и ставят в термостат. На второй день исследования со среды обогащения делают посев на чашки со средами Плоскирева, Эндо или Левина и Вильсона - Блера (висмут-сульфит-агар). В последующем этапы исследования те же, что при выделении гемокультуры.
Выделение бактерий тифо-паратифозной группы из мочи лучше производить со второй третьей недели болезни. Перед взятием материала следует обмыть стерильным изотоническим раствором натрия хлорида наружное отверстие мочеиспускательного канала; у женщин лучше брать мочу катетером. Для исследования берут 20-30 мл мочи. После центрифугирования осадок засевают в 2 чашки со средой Плоскирева или висмут-сульфит-агаром. Надосадочную жидкость засевают на среду обогащения (10% желчный бульон) и ставят в термостат на 24 ч, после чего производят посев в 2 чашки одной из элективных сред. Выделенные колонии идентифицируют обычным способом.
Исследование дуоденального содержимого - желчи. Метод чаще применяют в стадии реконвалесценции. Желчь собирают во время зондирования в стерильные пробирки. Дуоденальное содержимое засевают во флаконы с 50 мл бульона, а оставшуюся часть материала вместе с посевами помещают в термостат при 37° С. На следующий день делают посев в 2 чашки с плотной дифференциальной средой. Выделенные колонии идентифицируют по описанной методике.
Высокочувствительным и перспективным в ранней диагностике брюшного тифа и паратифов является метод иммунофлюоресценции, с помощью которого исследуют кровь с первых дней болезни, кал с 10-го дня, дуоденальное содержимое на 10-й день нормальной температуры тела. Специфическими флюоресцирующими сыворотками маркируют тифо-паратифозные бактерии, которые в последующем определяют при люминесцентной микроскопии. Метод позволяет диагностировать заболевание через 10-12 ч от начала исследования.
Серологическая диагностика тифо-паратифозных заболеваний. Со второй недели заболевания в крови больных появляются специфические антитела, которые можно определить с помощью реакции Видаля. При брюшном тифе и паратифах накапливаются О-, а затем и Н-агглютинины. В течение заболевания иногда обнаруживают и Vi-агглютинины, но последние, в отличие от но-сительства, не имеют диагностического значения. Определение в крови больных специфических агглютининов к возбудителю брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля) может оказать помощь в установлении диагноза как в остром периоде болезни, так и во время реконвалесценции.
При сальмонеллезах реакция Видаля является подсобным методом диагностики. Следует помнить, что нередко встречаются формы болезни со слабо выраженным иммунологическим ответом. Особенно часто низкие титры агглютининов, вплоть до их отсутствия, отмечают у больных, леченных антибиотиками.
Для реакции Видаля берут 1-3 мл крови из пальца или локтевой вены в стерильную пробирку. С целью ускорения свертывания крови ее ставят в термостат на 30 мин. Свернувшуюся кровь обводят стеклянной пипеткой и помещают в холодильник до появления прозрачной отстоявшейся сыворотки. Сгусток используют для посева (гемокультура). Реакцию агглютинации ставят с Н- и О-брюшнотифозными, А- и В-паратифозными диагностикумами. Сыворотку разводят, начиная с титра 1:100 до 1:800, по следующей методике. В пробирку наливают 9,9 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида и 0,1 мл испытуемой сыворотки - получают разведение 1:100. В 4 опытные пробирки (по числу антигенов, используемых в реакции Видаля), и в одну, служащую контролем сыворотки, разливают 5 мл разведенной сыворотки по 1 мл. Из оставшихся 5 мл сыворотки (разведения 1:100) 1 мл выливают, а к 4 мл добавляют 4 мл изотонического раствора натрия хлорида и получают разведение 1:200. 4 мл из разведения 1:200 разливают также в 4 пробирки по 1 мл, а к оставшимся 4 мл вновь добавляют 4 мл изотонического раствора натрия хлорида для получения разведения 1:400. Последующие разведения (1:800, 1:1600) производят описанным способом. В 4 пробирки, являющиеся контролем антигенов, вливают по 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. Во все опытные пробирки, исключая, те, которые служат контролем сыворотки, вливают по 1-2 капли соответствующих диагностикумов. Штатив с пробирками встряхивают и помещают в термостат при 37° С на 24 ч. Н-агглютинация (крупнохлопчатая) наступает через 2 ч, О-агглютинация (мелкозернистая) - значительно позже. Интенсивность реакции отмечают через 24 ч. Диагностический титр реакции Видаля в разведении не менее чем 1:200 при наличии клинических проявлений.
Следует учитывать, что эта реакция может быть положительной при других заболеваниях - туберкулезе, малярии, бруцеллезе, злокачественных новообразованиях и некоторых состояниях (беременности). Реакция Видаля может быть положительной и у здоровых лиц (бытовая реакция), у привитых и перенесших в прошлом заболевание (анамнестическая реакция). Для повышения специфичности реакции Видаля Фишер предложил разводить сыворотку гипертоническим раствором натрия хлорида (2,9 и 5,8%). Это приводит к ослаблению или ликвидации групповых реакций. Ценность реакции агглютинации повышается при повторных исследованиях, когда с динамикой заболевания устанавливают нарастание титра антител. При паратифе А реакция Видаля может быть отрицательной либо титр специфических антител меньше групповых.
В последние годы для распознавания кишечной группы заболеваний широко применяют реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) с парциальными антигенами брюшнотифозных бактерий. РПГА отливается высокой чувствительностью и специфичностью, бывает положительной с 5-го дня болезни. Минимальный диагностический титр у больных брюшным тифом, паратифами, сальмонеллезом с О-антигеном - 1:200. Реакцию ставят в динамике для определения нарастания титра антител.
Методы лабораторной диагностики бактерионосительства при брюшном тифе и паратифах. Бактериологическое исследование кала, мочи и дуоденального содержимого проводят по общепринятым методам. Лучшие результаты получают при использовании селенитовых сред.
В связи с периодичностью выделения бактерий нередко не удается высеять возбудителя. У подавляющего большинства носителей палочек брюшного тифа обнаруживают микробы, содержащие Vi-антиген, в связи с чем в крови острых и хронических носителей появляются Vi-антитела (в крови больных они бывают реже). Диагностический титр реакции 1:20 и выше. Параллельно с реакцией Vi-агглютинации (с прогретой сывороткой) ставится реакция Видаля (с нативной сывороткой) с Н- и О-брюшнотифозными диагностикумами. В сыворотках брюшнотифозных бактерионосителей Н-антитела в титре от 1:200 до 1:800 встречаются в 60-80% случаев. Наличие сочетания Н- и Vi-антител имеет особое диагностическое значение в выявлении носителей палочек брюшного тифа.
Из дополнительных методов исследования для выявления носительства палочек брюшного тифа применяют кожно-аллергическую пробу с тифином, а также РПГА с Vi-антигеном.
Таким образом, важным условием успеха борьбы с тифо-паратифозными заболеваниями является раннее и полное выявление и обезвреживание источника инфекций. В настоящее время брюшной тиф встречается спорадически. При этом течение болезни менее длительное и не сопровождается всеми типичными для классической формы признаками, что затрудняет клиническое распознавание.
В связи с изложенным комплексное лабораторное обследование приобретает важное значение.
УТВЕРЖДЕНЫ Министерством
здравоохранения РСФСР от 19 декабря 1991 г.
Методические рекомендации
составил А.Н.Калюк.
Бактериологические исследования на условно-патогенные микроорганизмы
Комплексное лабораторное
изучение микрофлоры включает бактериоскопическое и
бактериологическое исследования материала, проводимые в динамике
при поступлении на стационарное лечение, в процессе лечения, а
также по показаниям у больных, лечащихся амбулаторно. Посевы
диагностического материала целесообразно производить на плотные
питательные среды, что исключает подавление роста одного
микроорганизма другим и позволяет дать количественную оценку числа
выросших колоний. Интенсивность роста микроорганизмов может
выражаться в крестах и соответствовать содержанию определенного
количества микробных клеток в 1 мл диагностического материала:
++++ обильный рост
сливающихся колоний (10 м/кл)
+++ массивный рост
изолированных колоний (10 м/кл)
++ умеренный рост
множества сосчитываемых колоний (не менее 50) (10-10 м/кл)
+
скудный рост единичных колоний (30-50) (10 м/кл).
При дозированном посеве
определяют абсолютное содержание микроорганизмов в 1 мл или 1 г
исследуемого материала. Этиологически значимым содержанием бактерий
в 1 мл (1 г) материала признается 10 и выше. Количественное преобладание
определенного вида микроорганизма является одним из показателей его
участия в гнойно-воспалительном процессе. Окончательная
интерпретация результатов бактериологического исследования
производится после изучения анамнестических данных, клинической
симптоматики, результатов антибактериальной терапии. При
направлении материала на посев необходимо соблюдать определенные
правила. Материал должен быть исследован до начала
антибактериальной терапии или через такой период после введения
антибактериальных препаратов, который необходим для их элиминации
из организма больного (2-3 дня при анализах мокроты, 4-7 дней -
мочи). Применение антибиотиков в 3-4 раза снижает частоту выделения
микроорганизмов. Посевы диагностического материала проводятся в
динамике (3-5 раз), что уточняет этиологию заболевания, дает
возможность проследить длительность персистенции возбудителя,
контролировать эффективность проводимой терапии. Интервал между
сбором и посевом материала не должен превышать 1-2 ч.
Исследование микрофлоры
верхних дыхательных путей (глотка, нос, ротовая полость).
Материалом для исследования служат: слизь, гнойное отделяемое,
корочки, пленка, кусочки инфильтратов при биопсии. Материал для
микробиологического исследования из ротовой полости забирают
натощак стерильным ватным тампоном со слизистой оболочки у выхода
протоков слюнных желез, поверхности языка, из язвочек (соскоб
ложечкой), с наиболее пораженных мест. При наличии пленки последнюю
снимают пинцетом. Материал из носовой полости забирают сухим
стерильным ватным тампоном. Материал засевают на чашки Петри с
кровяным, желточно-солевым агарами, среду Сабуро. При посеве
тампоном материал втирают в среду со всей поверхности тампона на
небольшом участке 1-2 см, а затем штрихами по всей поверхности.
Одновременно с посевом приготавливают мазки и окрашивают по
Граму.
Исследование микрофлоры
нижних дыхательных путей. Основным материалом для исследования
является мокрота, которая собирается в день исследования, утром,
после чистки зубов и полоскания полости рта свежекипяченой водой.
При обильном выделении мокроты первые порции следует откашлять в
плевку, а последующие собираются в стерильную посуду и доставляются
в лабораторию. Для изучения микрофлоры мокроты применяют как посев
неразведенной мокроты (качественный метод), так и метод разведения,
который получил название количественного. При качественном методе
для посева используются гнойные комочки мокроты, отмытые в
физиологическом растворе от микрофлоры ротовой полости. При
количественных методах гомогенизируется 1 мл мокроты. Затем
производятся разведения, позволяющие уменьшить в ней количество
микроорганизмов ротовой полости. При обоих методах одновременно с
посевом приготавливается мазок, который окрашивается по Граму.
Исследованию подлежат гнойная и слизисто-гнойная мокрота, в которой
присутствуют лейкоциты и клетки альвеолярного эпителия, клетки,
вкрапленные в муцин, присутствие которых характерно для экскрета
нижних отделов дыхательных путей. Обращают внимание на
преобладающую в мазке нативной мокроты микрофлору, особенно
капсульные диплококки (пневмококки), мелкие грамотрицательные
палочки (палочка Пфейффера) и др.
Качественный метод. В
лаборатории мокроту выливают в чашку Петри, выбирают 2-3 гнойных
комочка, которые однократно отмывают в физиологическом растворе,
после чего засевают на кровяной и желточно-солевой агары, среды
Эндо и Сабуро. Посев производят стерильным стеклянным шпателем,
равномерно растирая материал на поверхности питательной среды. На
чашку с кровяным агаром сразу же после посева накладывают диски с
антибиотиками (стрептомицином, пенициллином, тетрациклином,
эритромицином и левомицетином), что позволяет получить
экспресс-информацию о лекарственной чувствительности преобладающей
в посеве микрофлоры. На второй день учитывают количество выросших
колоний (этиологически значимым считается рост более 50 колоний),
однородность популяции и лекарственную чувствительность при росте
их в монокультуре.
Количественный метод. Из
доставленной в лабораторию мокроты берут 1 мл, добавляют 9 мл
мясопептонного бульона и гомогенизируют в банке с бусами в течение
20 мин. Из полученной эмульсии готовят десятикратные
последовательные разведения. Посев осуществляют в обратном порядке
с меньшего разведения. Засевается по 0,1 мл из разведенной мокроты
10 и 10 на чашку с кровяным агаром. Посев на
желточно-солевой агар, среды Эндо и Сабуро делают из исходного
разведения 1:10. Посевы инкубируют в течение суток при 37°С. На
вторые сутки чашки просматривают и учитывают численность каждого из
видов микроорганизмов в миллионах. Диагностически значимым
признается содержание бактерий 10 м/кл и выше в 1 мл мокроты.
Посев промывных вод
бронхов, лаважной жидкости. Из исследуемого материала отбирают
комочки слизи, которые без предварительного отмывания в
физиологическом растворе засевают на плотные питательные среды (см.
посев мокроты) и в пробирку с сахарным бульоном. При отсутствии
комочков слизи производят посев материала, набранного в
пастеровскую пипетку. Инкубация в течение суток при 37°С.
Исследование микрофлоры
глаз. Пробы на исследование отбирает врач стерильным ватным
тампоном или стеклянной палочкой. Материал забирается с пораженных
мест и засевается в 0,5% сахарный бульон. В случае отсутствия роста
через 48 часов выдается отрицательный ответ.
Исследование мазков из
уха. Материал забирают стерильным ватным тампоном из слухового
канала и производят посев на кровяной и желточно-солевой агары,
среду Сабуро, втирая материал на участке среды, после чего
растирают по всей чашке.
Исследование мочи.
Исследованию подлежит средняя порция утренней мочи, полученная при
нормальном мочеиспускании или взятая катетером. Показателем
бактериурии, имеющим клиническое значение, считается наличие 100000
и более микробов в 1 мл мочи.
Первый день исследования.
Производят посев одной стандартной (3 мм) бактериологической петли
мочи (тщательно перемешанной) по секторам А, I, II и III в чашку
Петри с 5% кровяным или простым агаром. При этом в участке среды
сектора А делают посев, равномерно втирая материал по всей
поверхности, затем не беря нового материала, этой же петлей делают
посев штрихами на питательную среду в секторе I (3-4 штриха), из
сектора I во II, из II сектора - в III.
Таблица 1
Число колоний бактерий в различных секторах чашки Петри в зависимости от степени бактериурии (по В.С.Рабиновскому и В.В.Родоман)
|
Количество бактерий в 1 мл мочи |
Число колоний в различных секторах чашки Петри |
|||
|
Менее 1
тыс. |
роста нет |
роста нет |
||
|
очень большое |
||||
|
от единич. до 25 |
||||
Второй день исследования.
Определяют степень бактериурии по табл.1 в зависимости от того, в
каком секторе обнаружен рост колоний микроорганизма. При наличии
менее 100 тыс. микробов в 1 мл мочи рост колоний наблюдается только
в секторе А чашки Петри. Появление роста колоний в I секторе
указывает на более высокую степень бактериурии. Подсчет колоний в
секторе с наименьшим ростом не представляет труда. Метод секторных
посевов в большинстве случаев позволяет уже на второй день
исследования выделить возбудителя заболевания в чистой
культуре.
Исследование микрофлоры
ран, пунктатов, экссудатов, резецированных тканей. Экссудаты и
пунктаты засевают пастеровской пипеткой в пробирки с кровяным и
простым мясопептонным агаром, сахарным бульоном. Тампон с
диагностическим материалом засевают на чашки Петри с 5% кровяным и
10% желточно-солевым агарами. Материал втирается по краю среды, а
затем рассеивается по чашке при помощи этого же тампона или
бактериологической петли.
Исследование микрофлоры
женских половых органов. Выделения собирают с помощью стерильного
ватного тампона и засевают на чашки Петри с 5% кровяным агаром,
желточно-солевым агаром и в пробирку с сахарным бульоном, а также
на среду Эндо.
Исследование желчи. Желчь
собирают при зондировании или во время операции в стерильные
пробирки и доставляют в лабораторию не позднее 2 ч. от момента
забора. 0,1 мл желчи высевают на чашку с кровяным агаром и на среду
Эндо. Посевы и оставшийся исходный материал помещают в термостат
при 37°С. Через 24 часа учитывают результаты первичных посевов с
подсчетом количества колоний каждого вида на плотных питательных
средах.
Исследование крови. Кровь
сеют у постели больного после тщательной обработки кожи (спирт,
эфир). Из локтевой вены берут 10 мл крови, которую выливают в две
колбы: первую со 150-200 мл сахарного бульона и вторую с
тиогликолевой средой (по 5 мл). Посевы выдерживают в термостате в
течение 10 дней. На 2, 3, 5 и 10-й дни производят контрольные
высевы на чашки Петри с 5% кровяным агаром. Посев 5 мл крови можно
произвести во флакон с питательной средой в двух фазах: плотной и
жидкой (скос 5% кровяного агара с 1% глюкозы и 50 мл 0,5% сахарного
бульона). Такая методика исключает необходимость многократных
пересевов, устраняет возможность загрязнения посева микрофлорой
окружающей среды, позволяет учесть количество выросших колоний
(т.е. оценить напряженность бактериемии). Посев помещают в
термостат при 37°С на 10 суток. Ежедневно содержимое флаконов
взбалтывают и наклоном флакона смачивают поверхность скоса плотной
питательной среды. При появлении роста колоний на скосе кровяного
агара с них приготавливают мазки и далее идентифицируют по
общепринятым в бактериологии правилам. При отсутствии роста
микроорганизмов на 10-е сутки дается окончательный ответ - посев
крови стерилен.
Исследование на
дисбактериоз кишечника. На предварительно подготовленные и
взвешенные (подпергамент или вощанку) стерильные бумажки размером
3x2 берут произвольное количество фекалий и взвешивают на
торзионных весах. Бумажку вместе с материалом помещают в стерильную
пробирку. Вес навески фекалий, за вычетом веса бумажки, умножают на
9. Полученная после умножения сумма равна количеству
физиологического раствора, которое необходимо добавить в пробирку.
Разведение 1:10 (I).
Например: вес бумажки 20
мг
вес фекалий с бумажкой
420 мг
420-20=400 мг; 400
мг9=3600 (3,5 мл).
После эмульгирования
стеклянной палочкой или стерильной пипеткой взвеси дают отстояться
при комнатной температуре 10-15 мин и 0,1 мл переносят в следующую
пробирку с 9,9 мл физиологического раствора (разведение 10). Затем производят разведение фекалий до
титра 10. Из основного разведения (10) производят посев на плотные питательные
среды для выделения патогенных микробов семейства кишечных (среду
Плоскирева, Левина). Одновременно делают массивный (0,5-1,0) посев
на жидкие среды обогащения (Мюллера, селенитовую, магниевую). Из
пробирки, в которой фекалии разведены до 10, вносят по 0,1 мл на поверхность среды
Сабуро и ЖСА. Из разведения 10 производят посевы на чашки с 0,5% кровяным
агаром и среду Эндо по 0,1 мл. Для получения роста изолированных
колоний применяют стеклянные бусы или шпатели. Стеклянные круглые
бусы 12-14 штук (заранее простерилизованные) опускают в чашку с
посевным материалом. При легком покачивании чашки с бусами в
течение 1 мин материал равномерно распределяется по питательной
среде. Посев бусами начинают со среды, на которой посеяно
наибольшее разведение (10), перенося бусы на меньшее разведение. Для
выделения анаэробных бифидобактерий производят высев из разведений
10, 10 и 10 в 2 пробирки (по 0,1 и 1 мл)
регенерированной в течение 1 ч среды Блаурокка. После посева
пробирки энергично вращают между ладонями для равномерного
распределения взвеси. Среды для выращивания аэробов помещают в
термостат при 37°С (Сабуро - при 20°) на 18-24 часа. Рост анаэробов
на среде Блаурокка учитывают через 48-72 ч. На следующий день после
посева определяют количество кишечной палочки и других микробов в 1
г фекалий по числу колоний, выросших на соответствующей питательной
среде с пересчетом на количество посеянного материала и степени его
разведения. Так, если на среде Эндо выросло 30 лактозонегативных
колоний при посеве 0,1 мл фекалий из разведения 10 (1:100000), при расчете следует 30 умножить
на 10 и на 100000, т.е. в 1 г будет 30000000 лактозонегативных
энтеробактерий. Учитывают число лактозонегативных и гемолитических
колоний кишечной палочки, наличие стафилококка, протея и других
микроорганизмов. Определяются ферментативные свойства и
лекарственная чувствительность микроорганизмов. Из пробирок со
средой Блаурокка приготавливаются мазки. Под микроскопом
бифидобактерий имеют вид характерных грамположительных палочек,
утолщенных или разветвленных на концах, расположенных в виде
римской цифры V, часто в виде скоплений. В ответе бактериолога
указываются процент или абсолютное количество каждой группы
микроорганизмов.
Идентификация
микроорганизмов. Методы идентификации микроорганизмов основаны на
изучении морфологических, культуральных и биохимических, антигенных
и др. свойств культур.
Морфологические свойства
изучаются путем бактериоскопии диагностического материала и мазков
из колоний, выросших на плотных и жидких питательных средах
культур. Мазки на предметных стеклах фиксируют на пламени горелки
или в жидких фиксаторах (96°, спирт, смесь Никифорова) окрашивают
по Граму. При просмотре мазков из мокроты оценивают всю имеющуюся
микрофлору: наличие скоплений грамположительных кокков
(стафилококки, микрококки), цепочек грамположительных кокков
(стрептококки), мелких ланцетовидных диплококков, окруженных зоной
неокрасившейся капсулы (пневмококк), грамотрицательных кокков
(нейссерии); грамотрицательных палочек (кишечная, синегнойная,
протей); грамотрицательных палочек с закругленными концами,
окруженных капсулой в виде светлого ореола (клебсиелла), мелких
грамотрицательных палочек в виде скопления (гемофильные бактерии) и
др. Бактериоскопическое исследование является ориентировочным.
Дальнейшее исследование включает посев материала на питательные
среды, выделение чистых культур, их идентификацию и определение
лекарственной чувствительности. Культуральные свойства изучают при
просмотре выросших культур на плотных и жидких питательных средах.
На плотных средах учитывают размер колоний, цвет, прозрачность,
форму, наличие пигмента, гемолиз вокруг колонии и его характер и
т.д. На жидких средах отмечают их прозрачность, наличие осадка
(придонный рост) или пленки на поверхности среды. Исследование
биохимических свойств основывается на определении ферментативной
сахаролитической активности, способности утилизировать питательные
вещества в аэробных и анаэробных условиях культивирования.
Антигенные свойства культур изучаются при взаимодействии бактерий и
их антигенов с соответствующими антисыворотками (реакции
агглютинации, иммунофлюоресценции и др.). После изучения
морфологических и культуральных свойств осуществляют постановку
дифференциальных тестов с чистыми культурами микроорганизмов.
Грамположительные кокки.
Грамположительные кокки относятся к семейству Micrococcaceae,
включающему род Micrococcus и Staphylococcus и семейства
Streptococcaceae.
Семейство Micrococcaceae.
Для медицинской микробиологии необходимо дифференцировать
стафилококки от микрококков. Изучают морфологические свойства,
гемолиз, способность расти на среде с солью, пигментообразование,
ферментацию глюкозы до кислоты в анаэробных условиях, ферментацию
глицерина. Микрококки имеют в 2-3 раза больший размер клеток
(0,5-3,5 мкм), не ферментируют глюкозу в анаэробных условиях и
глицерин, имеют пигмент от желтого до розового. Дифференциация
различных видов стафилококка осуществляется по комплексу тестов:
плазмокоагулирующей способности, лецитиназной активности,
ферментации маннита в анаэробных условиях, пигментообразованию,
чувствительности к новобиоцину (тест - положительный у St. aureus и
St. epidermidis и отрицательный у St. saprophyticus). Для выделения
стафилококка исследуемый материал засевают на
дифференциально-диагностическую среду: желточно-солевой агар. При
окраске по Граму стафилококк окрашивается грамположительно и
располагается одиночно, попарно или образует скопления в виде
неправильных кучек. Стафилококк устойчив к повышенным концентрациям
в среде хлористого натрия (7-10%), что используется для его
выделения из патологического материала. При росте на мясопептонном
бульоне вызывает его равномерное помутнение и дает хлопьевидный
осадок. На плотных питательных средах стафилококк растет в виде
круглых блестящих колоний с ровными краями (0,5-1,5 мм в диаметре).
На второй день исследования оценивают количественный рост выросших
колоний, учитывают лецитиназную активность, выделяют чистую
культуру микроба (пересев на пробирки с молочным или простым
скошенным агаром). На третий день - ставят тесты для дифференциации
и на лекарственную чувствительность.
При определении
коагулазной активности пользуются лиофилизированной плазмой крови
кролика, разведенной стерильным физиологическим раствором 1:5 и
разлитой в стерильные пробирки по 0,5 мл в каждую. В пробирку
засевают 1 петлю суточной агаровой культуры исследуемого штамма и
помещают в термостат при 37°С. Учет результатов производят через 30
мин, 1 час, 2 часа и 24 часа. Положительными считаются все степени
свертывания плазмы от небольшого сгустка, остающегося неподвижным
при перевертывании пробирки.
Лецитиназная активность
определяется на желточно-солевом агаре. Учет реакции производят
через 24-48 часов макроскопически по наличию мутной зоны и
радужного венчика вокруг колоний стафилококка, что свидетельствует
о наличии у них фермента лецитиназы.
При изучении ферментации
маннита посев суточной агаровой культуры испытуемого штамма
производят уголком в столбик 1% агара с маннитом и вазелиновым
маслом. При ферментации маннита столбик агар синеет. Положительной
считается реакция при ферментации 2/3 столбика агара.
Для определения
пигментообразования культуры стафилококка засевают на 10% молочный
агар. Учет через 18-20 часов.
Определение
гемолитической способности культуры стафилококка осуществляется на
5% кровяном агаре (донорская кровь без добавления антисептиков) по
наличию просветления вокруг выросших колоний, которые четко
выявляются в проходящем свете. Положительный гемолитический тест на
агаре с кровью человека, как правило, обусловлен гемотоксинами,
тогда как основную роль в патогенезе стафилококковых инфекций
играет альфа-токсин, который можно выявить на агаре с кровью
кролика.
Семейство
Streptococcaceae. Стрептококки представляют собой большую и
довольно гетерогенную группу микроорганизмов. Наиболее изученными
являются аэробные представители: Streptococcus pyogenes, S.
faecalis, S. pneumoniae. Микроб имеет сферическую форму,
грамположителен, в мазках с плотных питательных сред располагается
в виде коротких цепочек из 2-3 кокков, на жидких питательных средах
дает более длинные цепочки. При выращивании стрептококков следует
учитывать их повышенную потребность в питательных веществах.
Поэтому для культивирования стрептококка применяют питательные
среды, содержащие глюкозу (1%), кровь (5-10%), сыворотку
(10-20%).
Культуральныйметод исследования представляет собой выделение из питательной средыбактерий определённого вида путём культивирования,с их последующей видовой идентификацией. Вид бактерий определяется с учётом их строения, культуральных и экологических данных, а также генетических, биохимических и биологических показателей. Для проведения бактериологической диагностики используются схемы, которые утверждены Минздравом.
Выведенные из питательной среды новые виды бактерий, свойства которых ещё не определены, называются чистой культурой . После окончательной идентификации их характеристик, бактерии,выведенные из определённого места и в определённое время, получают название штамм. При этом допускается незначительное различие в свойствах, месте или времени выделения штамма одного вида.
Цель метода :
1. Этиологический диагноз, то есть выделение и идентификация чистой культуры бактерий.
2. Определение количества микроорганизмов и их особых характеристик. Например, специфическая реакция на антибиотики.
3. Выявление внутриродовых отличий микроорганизмов, на основе их эпидемиологической и генетической составляющей. Это необходимо для определения общности микроорганизмов выделенных в разных местах и разных условиях, что важно для эпидемиологических целей.
Данный метод исследования имеет определённый ряд этапов, различных для аэробных, факультативных и облигатных аэробных бактерий.
Выведение чистой культуры для аэробных и факультативных аэробных бактерий.
1 этап
А) Подготовительные мероприятия . Эта стадия включает в себя забор, хранение итранспортировку материала. Также, при необходимости, может проводиться его обработка, в зависимости отсвойств изучаемых бактерий. Например, при обследовании материала на туберкулёз, для выявления кислоустойчивых микробактерий используются растворы щёлочи или кислоты.
Б) Обогащение . Данная стадия не является обязательной и проводится в том случае, если количества бактерий в исследуемом материале недостаточно для проведения полноценного исследования. Например, при выделении гемокультуры, исследуемую кровь помещают в среду в соотношении 1 к 10 и хранят в течение суток при температуре 37 о.
В) Микроскопия . Мазок исследуемого материала окрашивается и изучается под микроскопом - исследуется микрофлора, её свойства и количество. В дальнейшем из первичного мазка необходимо отдельно выделить все находящиеся в нём микроорганизмы.
Г) Создание отдельных колоний . На чашку, со специальной, селективной средой, наносится материал, для этого используют петлю или шпатель. Далее, устанавливают чашку вверх дном, для защиты колоний от конденсата, и хранят в термостате около 20 часов, поддерживая температуру 37 о.
Важно! Следует помнить, что в процессе исследования, необходимо придерживаться правил изоляции. С одой стороны, для защиты исследуемого материала и выводимых бактерий, и с другой стороны, для предотвращения заражения окружающих лиц и внешней среды.
Что касается условно-патогенных микроорганизмов, то при их выведении, имеет значение их количественная характеристика. В этом случае, проводится количественный посев, при котором проводят несколько стократных разведений материала в изотоническом растворе хлорида натрия. После, осуществляют посев в чашки Петри по 50 мкл.
2 этап
А) Изучение морфологических свойств колоний в средах и их микроскопия . Исследуются чашки и отмечаются свойства микроорганизмов, показатели их количества, темпы роста, а также отмечается наиболее подходящая питательная среда. Для изучения лучше всего выбрать колонии, располагающиеся ближе к центру, и если образуется несколько типов чистых культур, то изучить каждую в отдельности.Для изучения морфотипной чистоты культуры используют мазок колонии, его окрашивают (обычно используется метод по Граму или же любой другой) и тщательно микроскопируют.
Б) Накопление чистой культуры . Для этого колонии всех морфотипов рассаживают в отдельные пробирки с питательной средой и содержат в термостате при определённой температуре(для большинства микроорганизмов подходящей является температура 37 о, но в некоторых случаях может быть иной).
Питательной средой для накопления часто служит среда Клиглера.Она имеет «скошенный» вид в пробирках, где 2/3 её части в виде столбика, а 1/3 – скошенная поверхность, окрашена в светло-красный цвет. Состав:
· МПА
· 0,1% глюкозы
· 1% лактозы
· Специальный реактив на сероводород
· Феноловыйкрасный индикатор.
3 этап
А) Уровень роста и чистоты культуры . В общем порядке, выведенная чистая культура имеет однородный рост и при микроскопическом рассмотрении клетки имеют одинаковое морфологическое и тинкториальное строение. Но встречаются некоторые виды бактерий с ярковыраженным плеофоризмом, при этом, встречаются клетки, имеющие различное морфологическое строение.
Если в качестве питательной среды использовалась среда Клиглера, то по изменению цвета столбика и скошенной части определяются биохимические характеристики. Например, если происходит разложение лактозы - желтеет скошенная часть, если глюкозы - пожелтение столбика; при продукции сероводорода происходит почернение из-за перехода сульфата в сульфид железа.
Как можно заметить на рисунке, среда Клиглера имеет свойство изменять свой цвет. Это происходит из-за того, что расщепление бактериями азотистых веществ и образование продуктов щёлочи происходит неоднородно как в столбике (анаэробные условия), так и на скошенной поверхности (аэробные условия).
В аэробной среде (скошенная поверхность) наблюдается более активное образование щёлочи, чем в анаэробной среде (столбик). Поэтому, когда происходит разложение глюкозы, кислота на скошенной поверхности без труда нейтрализуется. Но, при разложении лактозы, концентрация которой намного больше, кислоту не выходит нейтрализовать.
Что касается анаэробной среды, то щелочных продуктов генерируется крайне мало, поэтому здесь можно наблюдать, как глюкоза ферментируется.
Рис. Питательная среда Клиглера:
1 – исходная среда,
2 – рост E. coli,
3 – рост S. paratyphi B,
4 – рост S. Typhi.
E . coli – способствует разложению глюкозы и лактозы с образованием газов, не производит водород. Вызывает пожелтение всей среды с разрывами.
S. paratyphi –
способствует разложению глюкозы с образованием газов, лактозоотрицателен. Скошенная часть цвет не изменяет, столбик – желтеет.
S. paratyphi A-
не продуцирует сероводород.
S. paratyphi B –
сероводород продуцируется (по ходу укола проявляется чёрный цвет).
S. typhi – глюкоза разлагается без газообразования, сероводород продуцируется, лактозоотритателен. Скошенная часть не изменяет цвета, столбик – желтеет и среда чернеет по ходу укола.
Shigella spp.- лактозоотрицателен, глюкозоположителен, сероводород не продуцируется. Столбик приобретает жёлтый оттенок, а скошенная часть остаётся прежней.
Б) Финальная идентификация чистой культуры и её реакция на антибиотики . На данном этапе изучаются биохимические, биологические, серологические и генетические свойства культуры.
В исследовательской практике не возникает необходимости в изучении полного спектра свойств микроорганизмов. Достаточно использовать простейшие тестирования для определения принадлежности микроорганизмов к тому или иному виду.
Цель:
1. Освоить III этап бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний.
Знать:
1. Цель и последовательность выполнения III этапа бактериологического метода выделения чистых культур аэробных микроорганизмов.
2. Понятие «вид». Критерии вида.
3. Метаболизм микроорганизмов и его особенности.
4. Принцип и методы изучения биохимической активности микроорганизмов.
5. Цель и методы определения антибиотикограмм микроорганизмов в клинической микробиологии.
Уметь:
1. Определить чистоту исследуемой культуры.
2. Посеять исследуемую культуру на «пестрый ряд», среду для определения подвижности.
3. Определить антибиотикограмму исследуемой культуры диско-диффузионным методом.
1. Цель и последовательность выполнения III этапа бактериологического метода выделения аэробов.
2. Методы определения чистоты исследуемой культуры.
3. Классификация микроорганизмов по типам питания. Механизмы поступления питательных веществ в бактериальную клетку.
4. Ферменты микроорганизмов; их значение в метаболизме клетки. Конститутивные и индуцибельные ферменты.
5. Цель и методы изучения биохимической активности микроорганизмов в микробиологической практике.
6. Прямые и косвенные методы определения подвижности микроорганизмов.
7. Диско-диффузионный метод определения антибиотикограмм: сущность, методика постановки.
Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):
1. Провести III этап бактериологического метода выделения чистых культур аэробов:
Определить чистоту выделенной культуры;
Посеять чистую исследуемую культуру на короткий «пестрый ряд»;
Посеять исследуемую культуру в столбик полужидкого агара;
Определить антибиотикограмму исследуемой культуры диско-диффузионным методом.
2. Ознакомиться с системами для биохимической идентификации бактерий.
Методические указания к выполнению исследовательского задания:
1. Проведение III этапа бак. метода выделения чистых культур аэробов:
1.1. Определение чистоты выделенной культуры.
О чистоте культуры свидетельствует однородность роста и наличие в препарате микроорганизмов одного вида. Поэтому при макроскопическом исследовании роста, отмечая его интенсивность (скудный, умеренный, обильный), прозрачность, цвет обратите внимание на его однородность. Приготовьте фиксированный препарат, коснувшись петлей нижней, средней и верхней части косяка, окрасьте по Граму и промикроскопируйте. Полученные результаты внесите в протокол и сделайте вывод. В том случае, если выделенная Вами культура чистая, приступайте к дальнейшему ее исследованию.
1.2. Посев культуры на «пестрый ряд».
Проведите посев чистой исследуемой культуры на «пестрый ряд»: полужидкие среды Гисса с индикатором ВР, углеводами (глюкоза, лактоза, маннит) и МПБ.
Пересев в полужидкие среды осуществляется бактериологической иглой или бак. петлей диаметром 1 мм уколом в толщу агара, не доходя до дна пробирки »1 мм. При пересеве в жидкие среды петлю с биомассой исследуемой культуры погружают в жидкость, растирают на стенке пробирки и смывают. После этого между стенкой пробирки и пробкой помещают индикаторные бумажки для определения индола и сероводорода (H 2 S), не допуская смачивания краев пробирки и пробки питательной средой!
Основой изучения биохимических свойств микроорганизмов с целью их идентификации является определение промежуточных и (или) конечных продуктов метаболизма. Таксономическое значение имеют сахаролитические и протеолитические свойства бактерий, которые определяют на дифференциально-диагностических средах, входящих в состав «пестрого ряда».
Определение сахаролитических свойств производится на средах Гисса. Их состав: пептонная вода, 1% углевода, индикатор Андреде (ВР или др.), 0,3-0,5% агара, если среда полужидкая; если среда жидкая, то в пробирки опускают поплавки (короткие стеклянные трубочки, запаянные с одного конца).
Критерии учета результатов:
· цвет среды не меняется - культура не ферментирует углевод;
· цвет среды изменяется (в случае использования индикатора Андреде – со светло-желтого на красный, ВР – с розового на синий и т. д.) – культура ферментирует углевод с образованием кислых продуктов (органических кислот);
· цвет среды изменяется и наблюдается появление пузырьков газа в среде или поплавке - культура ферментирует углевод с образованием кислых и газообразных продуктов.
Определения протеолитических свойств производится на пептонной воде (ПВ) или мясо-пептонном бульоне (МПБ) с учетом образования конечных продуктов метаболизма белков (пептона, аминокислот) – индола, H 2 S, а в ряде случаев аммиака.
Образование индола сопровождается окрашиванием в розовый цвет индикаторной бумажки, пропитанной раствором щавелевой кислоты (метод Мореля); образование сероводорода – почернение индикаторной бумажки, пропитанной ацетатом свинца; образование аммиака – посинением лакмусовой бумажки.
МПБ и ПВ предназначены также для изучения характера роста микроорганизмов в жидкой питательной среде. Рост микробов может быть в виде диффузного помутнения, придонного осадка, пленки на поверхности среды.
1.3. Посев исследуемой культуры в столбик полужидкого агара.
Произведите посев исследуемой культуры в столбик полужидкого агара уколом с помощью бак. иглы или бак. петли диаметром 1 мм.
Посев культуры в столбик полужидкого агара позволяет определить ее отношение к молекулярному кислороду, а значит и косвенно составить представление о способе получения энергии. Критерием учета и оценки является характер роста: рост только сверху среды – культура является аэробом , только в нижней чсти среды – анаэробом ; сверху и по уколу – факультативным анаэробом ; рост на некотором расстоянии от поверхности среды – микроаэрофиллом .
При этом способе посева у факультативно-анаэробных микроорганизмов можно определить подвижность. Рост строго по уколу – культура неподвижна, рост диффузный – подвижна.
1.4. Определение антибиотикограммы исследуемой культуры диско-диффузионным методом.
Этиотропную антимикробную химиотерапию клиницисты проводят с учетом результатов бак. метода, который наряду с выделением возбудителя из клинического материала и его идентификацией включает определение чувствительности к антимикробным химиопрепаратам. Для определения чувствительности в России чаще всего используют диско-диффузионный метод (ДДМ).
Для определения антибиотикограммы приготовьте взвесь исследуемой культуры в стерильном физиологическом растворе и доведите до мутности 0,5 по МакФарланду (1,5 х 10 8 КОЕ/мл). Для посева используйте стерильный ватный тампон, который погрузите в пробирку с суспензией, ротируйте его, чтобы он равномерно пропитался, а затем тщательно отожмите о сухую стенку пробирки выше уровня жидкости путем покручивания. Посев культуры на чашку со средой АГВ проведите штрихами в трех направлениях под углом 60°, каждый раз поворачивая чашку вокруг своей оси. В заключение сделайте несколько вращательных движений тампоном по краям агаровой поверхности. После этого посевам дайте возможность подсохнуть в течение нескольких минут при комнатной t° в чашках с закрытыми крышками. Диски с антибиотиками нанесите не позднее 15 мин после инокуляции стерильным пинцетом или с помощью автоматического диспенсора. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15-20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм помещают не более 6 дисков. Каждый диск следует аккуратно прижать пинцетом, чтобы обеспечить его контакт с питательной средой. Чашки непосредственно после наложения дисков подпишите и поместите вверх дном в термостат при 37° на 18-20 ч.
Применение бактериологического метода дает возможность выделить возбудителя в чистой культуре из материала, полученного от больного, и идентифицировать его на основании изучения комплекса свойств. Большинство бактерий способны к культивированию на различных искусственных питательных средах (кроме хламидий и риккетсий), поэтому бактериологический метод имеет важное значение в диагностике многих инфекционных болезней.
В случае получения положительного результата бактериологический метод позволяет определить чувствительность выделенного возбудителя к антимикробным препаратам. Однако эффективность указанного исследования зависит от многих параметров, в частности от условий сбора материала и его транспортировки в лабораторию.
К основным требованиям , предъявляемым к отбору и транспортировке материала для бактериологического исследования, относят:
- взятие материала до начала этиотропного лечения;
- соблюдение условий стерильности при сборе материала;
- техническую правильность сбора материала;
- достаточное количество материала;
- обеспечение температурного режима хранения и транспортировки материала;
- сведение к минимальному промежутка времени между сбором материала и посевом на плотные питательные среды.
Транспортировка материала в лабораторию должна быть осуществлена по возможности немедленно, но не более чем в течение 1—2 ч после его взятия. Пробы материала должны находиться при определенном температурном режиме; в частности, стерильные в норме материалы (кровь, спинномозговая жидкость) хранят и доставляют в лабораторию при 37 °С. Нестерильные материалы (моча, отделяемое дыхательных путей и др.) хранят при комнатной температуре не более 1-2 ч или не более суток при 4 °С (условия бытового холодильника). При невозможности доставки проб в лабораторию в регламентированные сроки рекомендуют использовать транспортные среды, предназначенные для сохранения жизнеспособности возбудителей в условиях консервации.
Кровь для исследования следует брать у больного в период подъема температуры тела, в начале появления лихорадки. Рекомендуется исследовать 3-4 пробы крови, взятые с интервалом 4-6 ч, что обоснованно с точки зрения снижения риска «упустить» транзиторную бактериемию и повышения возможности подтвердить этиологическую роль выделенной из крови условно-патогенной микрофлоры, если эта микрофлора обнаруживается в нескольких пробах венозной крови. Пробу крови в количестве 10 мл у взрослого и 5 мл у детей засевают минимум в два флакона со средой для аэробных и анаэробных микроорганизмов в соотношении 1:10. Желательно однократное исследование и артериальной крови.
Взятие спинномозговой жидкости (СМЖ) производит врач при люмбальной пункции в количестве 1-2 мл в сухую стерильную пробирку. Пробу немедленно доставляют в лабораторию, где к ее исследованию приступают также немедленно. При отсутствии такой возможности материал сохраняется при 37 °С в течение нескольких часов. Существенно повышает количество положительных результатов бактериологического исследования посев 1-2 капель СМЖ в пробирку, содержащую полужидкую среду с глюкозой, и в чашку Петри с «кровяным» агаром. Для пересылки материала используют изотермальные ящики, грелки, термосы или любую другую упаковку, где поддерживается температура около 37 °С.
Испражнения для бактериологического исследования отбирают с помощью стерильных деревянных шпателей в количестве 3-5 г в стерильный сосуд с плотно закрывающейся крышкой. Исследование взятого материала должно быть начато не позже чем через 2 ч. Если невозможно приступить к исследованию в течение этого времени, следует отобрать небольшое количество материала, который помещают в соответствующую транспортную среду. При отборе испражнений следует стремиться направлять для исследования патологические примеси (слизь, гной, частицы эпителия и др.), если они имеются, избегая попадания в материал примеси крови, обладающей бактерицидными свойствами.
Для взятия материала могут быть использованы ректальные тампоны (с ватным наконечником). Тампон должен быть увлажнен стерильным изотоническим раствором натрия хлорида или транспортной средой (но не масляным гелем). Его вводят per rectum на глубину 5-6 см и, поворачивая тампон, осторожно его извлекают, контролируя появление на тампоне фекальной окраски. Тампон помещают в сухую пробирку, если к исследованию материала приступят в течение 2 ч, в ином случае - в транспортную среду.
Мочу (средняя порция свободно выпущенной мочи) в количестве 3-5 мл собирают в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Предпочтительней отбирать утренние порции мочи.
Желчь собирают во время дуоденального зондирования в процедурном кабинете отдельно по порциям А, В и С в три стерильные пробирки, соблюдая правила асептики.
Промывные воды желудка собирают в стерильные банки в количестве 20-50 мл. Следует иметь в виду, что промывание желудка в этих случаях проводят только индифферентными (не обладающими бактериостатическим или бактерицидным действием на микроорганизмы) растворами - лучше кипяченой водой (без добавления соды, перманганата калия и пр.).
Мокрота . Утреннюю мокроту, выделяющуюся во время приступа кашля, собирают в стерильную банку. Перед откашливанием больной чистит зубы и полощет рот кипяченой водой с целью механического удаления остатков пищи, слущенного эпителия и микрофлоры ротовой полости.
Промывные воды бронхов . При бронхоскопии вводят не более 5 мл изотонического раствора натрия хлорида с последующим его отсасыванием в стерильную пробирку.
Отделяемое глотки, ротовой полости и носа . Материал из ротовой полости берут натощак или через 2 ч после еды стерильным ватным тампоном либо ложечкой со слизистой оболочки и ее пораженных участков у входов протоков слюнных желез, поверхности языка, из язвочек. При наличии пленки последнюю снимают стерильным пинцетом. Материал из носовой полости забирают сухим стерильным ватным тампоном, который вводят в глубь полости носа. Материал из носоглотки берут стерильным заднеглоточным ватным тампоном, который осторожно вводят через носовое отверстие в носоглотку. Если при этом начинается кашель, тампон не удаляют до окончания кашля. Для проведения анализа на дифтерию исследуют одновременно пленки и слизь из носа и глотки, беря материал разными тампонами.
Исследуемый материал засевают на плотные питательные среды, используя специальные методики для получения роста отдельных колоний микроорганизмов, которые далее отсевают с целью выделения чистой культуры возбудителя.
Определенные виды бактерий выделяют, используя элективные (избирательные) среды, которые задерживают рост посторонних микроорганизмов или содержат вещества, стимулирующие рост определенных патогенных микробов.
Выделенные на питательных средах микроорганизмы идентифицируют , т.е. определяют видовую или типовую их принадлежность. В последнее время для идентификации в практике здравоохранения используют микротест-системы, представляющие собой панели с набором дифференциально-диагностических сред, что ускоряет исследование. Микротест-системы применяют и для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам методом разведения антибиотика в жидкой питательной среде.
Оценивая результаты бактериологического исследования, врач должен учитывать, что отрицательный результат не всегда означает отсутствие возбудителя и может быть связан с применением антимикробных препаратов, высокой микроцидной активностью крови, техническими погрешностями. Обнаружение патогенного микроба в материале от больного вне связи с клинической картиной возможно в случае реконвалесцентного, здорового или транзиторного бактерионосительства.
Выделение из крови при соблюдении всех правил асептики условно-патогенных микроорганизмов (эпидермальный стафилококк, кишечная палочка) и даже сапрофитов следует считать проявлением бактериемии, особенно если эти микробы обнаружены больше чем в одной пробе материала или в разных субстратах (кровь, моча), поскольку при снижении иммунореактивности организма эти и другие «непатогенные» микроорганизмы могут быть возбудителями инфекционных процессов, в том числе и сепсиса.
Определенную сложность представляет трактовка результатов бактериологического исследования нестерильных сред , а именно доказательство этиологической роли условно-патогенных микроорганизмов. В этом случае учитывают в комплексе такие показатели, как вид выделенных культур, количество микробных клеток данного вида в материале, повторное их выделение в течение заболевания, присутствие монокультуры или ассоциации микроорганизма.
Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я.