Хотя весь полиморфизм - результат различий в последовательности ДНК, некоторые полиморфные локусы исследованы проверкой изменений в белках, кодируемых этими аллелями, а не изучением различий в ДНК-последовательности самих аллелей. Считают, что любой человек вероятно гетерозиготен по аллелям, определяющим структурно различающиеся полипептиды, приблизительно в 20% всех локусов; при сравнении индивидуумов из разных этнических групп полиморфизм обнаруживают даже в большей доле белков.

Таким образом, в пределах человеческого вида существует поразительная степень биохимической индивидуальности в характеристиках ферментов и других продуктов генов. Кроме того, поскольку продукты многих биохимических путей взаимодействуют, можно правдоподобно предположить, что каждый человек, независимо от состояния его здоровья, имеет уникальные, генетически определяемые биохимические характеристики и, таким образом, уникально отвечает на влияния окружающей среды, диетические и фармакологические факторы.

Это понятие химической индивидуальности , впервые выдвинутое столетие назад замечательным британским врачом Арчибальдом Гарродом, оказалось правильным.

Здесь мы обсудим несколько полиморфизмов , имеющих медицинское значение: группы крови АВО и резус-фактор Rh (важные в определении совместимости для переливаний крови) и МНС (играющий важную роль в пересадке органов и тканей). Исследования изменений в белках, а не в кодирующей их ДНК, дают реальную пользу; в конце концов, именно различные белковые продукты различных полиморфных аллелей часто ответственны за различные фенотипы и, следовательно, определяют, как генетические изменения в локусе влияют на взаимодействие организма и среды.

Группы крови и их полиморфизмы

Первые примеры генетически предопределенных изменений белков были обнаружены в эритроцитах, так называемые антигены групп крови. Известно большое число полиморфизмов в компонентах человеческой крови, особенно в АВО и Rh антигенах эритроцитов. В частности, системы АВО и Rh важны при переливании крови, пересадке тканей и органов и при гемолитической болезни новорожденного.

Система АВО групп крови

Человеческая кровь может относиться к одной из четырех групп, в соответствии с наличием на поверхности эритроцитов двух антигенов, А и В, и присутствия в плазме двух соответствующих антител, анти-А и анти-В. Существует четыре основных фенотипа: 0, А, В и АВ. Люди с группой А имеют на эритроцитах антиген А, с группой В имеют антиген В, с группой АВ - как антигены А, так и В, и наконец с группой 0 не имеют ни одного антигена.

Одна из характеристик групп АВО не распространяется на другие системы групп крови - это реципрокные отношения между наличием антигенов на эритроцитах и антител в сыворотке. Когда на эритроцитах отсутствует антиген А, сыворотка содержит анти-А антитела; когда отсутствует антиген В, сыворотка содержит анти-В антитела. Причина реципрокного отношения неизвестна, но полагают, что образование анти-А и анти-В антител - ответ на присутствие А- и В-подобных антигенов в окружающей среде (например, в бактериях).

Определяются локусом в хромосоме 9. Аллели А, В и 0 в этом локусе - классический пример мультиаллелизма, когда три аллеля, два из которых (А и В) наследуются как кодоминантные, а третий (0) - как рецессивный признак, определяют четыре фенотипа. Антигены А и В определяются действием аллелей А и В на поверхностный гликопротеид эритроцитов, названный антигеном Н.

Специфичность антигенов определяется концевыми углеводами, добавляемыми к субстрату Н. Аллель В кодирует гликозилтрансферазу, преимущественно опознающую сахар D-галактозу и добавляющую его к концу цепочки олигосахаридов, содержащейся в антигене Н, тем самым создавая антиген В. Аллель А кодирует немного отличающуюся форму фермента, распознающую и добавляющую к субстрату вместо D-галактозы N-ацетилгалактозамин, создавая тем самым антиген А. Третий аллель, 0, кодирует мутантную версию трансферазы, не обладающую трансферазной активностью и не влияющую на субстрат Н.

Определены молекулярные различия в гене гликозилтрансферазы , ответственной за аллели А, В и 0. Последовательность из четырех различных нуклеотидов, различающаяся между аллелями А и В, приводит к изменениям аминокислот, изменяющим специфичность гликозилтрансферазы. Аллель 0 имеет однонуклеотидную делецию в кодирующей области гена АВО, вызывающую мутацию сдвига рамки и инактивирующую активность трансферазы у людей с группой 0. Теперь, когда известны ДНК-последовательности, определение групповой принадлежности по системе АВО можно выполнять непосредственно на уровне генотипа, а не фенотипа, особенно когда есть технические трудности в серологическом анализе, что часто случается в судебной практике или при установлении отцовства.

На видео представлена техника определения группы крови стандартными сыворотками:

Первичное медицинское значение системы АВО - в переливании крови и пересадке тканей или органов. В системе групп крови АВО есть совместимые и несовместимые комбинации. Совместимая комбинация - когда эритроциты донора не несут антиген А или В, соответствующий антителу в сыворотке реципиента. Хотя теоретически существуют «универсальные» доноры (группа 0) и «универсальные» реципиенты (группа АВ), пациенту переливают кровь его собственной группы АВО, за исключением экстренных ситуаций.

Постоянное присутствие анти-А и анти-В антител объясняет неудачи многих ранних попыток переливания крови, поскольку эти антитела могут вызывать быстрое уничтожение АВО-несовместимых клеток. При пересадке тканей и органов для успешного приживания необходима совместимость донора и реципиента по группе АВО и HLA (описанной позже).

Система Rh групп крови

По клиническому значению система Rh сравнима с системой АВО из-за своей роли в развитии гемолитической болезни новорожденных и в несовместимости при переливаниях крови. Название Rh происходит от обезьян резусов (Rhesus), использовавшихся в экспериментах, приведших к открытию системы. Проще говоря, популяция разделяется на Rh-положительных индивидуумов, экспрессирующих в эритроцитах антиген Rh D, полипептид, закодированный геном (RHD) в хромосоме 1, и Rh-отрицательных, не экспрессирующих этот антиген. Отрицательный Rh-фенотип обычно вызван гомозиготностью по нефункциональному аллелю гена RHD. Частота Rh-отрицательных индивидуумов сильно изменяется в разных этнических группах. Например, 17% белых и 7% афроамериканцев Rh-отрицательны, тогда как среди японцев - всего 0,5%.

Гемолитическая болезнь новорожденных и группы крови

Главное клиническое значение системы Rh - то, что Rh-отрицательные лица могут легко формировать анти-Rh антитела после встречи с Rh-положительными эритроцитами. Это становится проблемой, когда Rh-отрицательная беременная вынашивает Rh-положительный плод. В норме в течение беременности небольшие количества крови плода пересекают плацентарный барьер и попадают в материнский кровоток. Если мать Rh-отрицательна, а плод Rh-положителен, мать формирует антитела, возвращающиеся к плоду и повреждающие его эритроциты, вызывая гемолитическую болезнь новорожденных с серьезными последствиями.

У Rh-отрицательных беременных риск иммунизации Rh-положительными эритроцитами плода может минимизироваться введением антирезус иммуноглобулина на сроке 28-32 нед гестации и дополнительно вскоре после родов. Иммуноглобулин человека антирезус удаляет Rh-положительные клетки плода из кровотока матери прежде, чем они ее сенсибилизируют. Антирезус иммуноглобулин также вводят после выкидышей, абортов или инвазивных процедур типа БВХ или амниоцентеза, в случаях, когда Rh-положительные клетки плода попадают в материнский кровоток. Открытие системы Rh и ее роли в развитии гемолитической болезни новорожденных - важный вклад генетики в медицину.

Функции. Группы крови - это генетически наследуемые признаки, не изменяющиеся в течение жизни при естественных условиях. Группа крови представляет собой определенное сочетание поверхностных антигенов эритроцитов (агглютиногенов) системы АВО.Определение групповой принадлежности широко используется в клинической практике при переливании крови и ее компонентов, в гинекологии и акушерстве при планировании и ведении беременности. Система групп крови AB0 является основной системой, определяющей совместимость и несовместимость переливаемой крови, т.к. составляющие ее антигены наиболее иммуногенны. Особенностью системы АВ0 является то, что в плазме у неиммунных людей имеются естественные антитела к отсутствующему на эритроцитах антигену. Систему группы крови АВ0 составляют два групповых эритроцитарных агглютиногена (А и В) и два соответствующих антитела - агглютинины плазмы альфа(анти-А) и бета(анти-В). Различные сочетания антигенов и антител образуют 4 группы крови:

• Группа 0(I) - на эритроцитах отсутствуют групповые агглютиногены, в плазме присутствуют агглютинины альфа и бета.
• Группа А(II) - эритроциты содержат только агглютиноген А, в плазме присутствует агглютинин бета;
• Группа В(III) - эритроциты содержат только агглютиноген В, в плазме содержится агглютинин альфа;
• Группа АВ(IV) - на эритроцитах присутствуют антигены А и В, плазма агглютининов не содержит.

Определение групп крови проводят путем идентификации специфических антигенов и антител (двойной метод, или перекрестная реакция).

Несовместимость крови наблюдается, если эритроциты одной крови несут агглютиногены (А или В), а в плазме другой крови содержатся соответствующие агглютинины (альфа- или бета), - при этом происходит реакция агглютинации.

Переливать эритроциты, плазму и особенно цельную кровь от донора к реципиенту нужно строго соблюдая групповую совместимость. Чтобы избежать несовместимости крови донора и реципиента, необходимо лабораторными методами точно определить их группы крови. Лучше всего переливать кровь, эритроциты и плазму той же группы, которая определена у реципиента. В экстренных случаях эритроциты группы 0 (но не цельную кровь!) можно переливать реципиентам с другими группами крови; эритроциты группы А можно переливать реципиентам с группой крови А и АВ, а эритроциты от донора группы В - реципиентам группы В и АВ.

Карты совместимости групп крови (агглютинация обозначена знаком +):

Кровь донора	Кровь реципиента

Эритроциты донора	Кровь реципиента

Групповые агглютиногены находятся в строме и оболочке эритроцитов. Антигены системы АВО выявляются не только на эритроцитах, но и на клетках других тканей или даже могут быть растворенными в слюне и других жидкостях организма. Развиваются они на ранних стадиях внутриутробного развития, и у новорожденного уже находятся в существенном количестве. Кровь новорожденных детей имеет возрастные особенности - в плазме могут еще не присутствовать характерные групповые агглютинины, которые начинают вырабатываться позже (постоянно обнаруживаются после 10 месяцев) и определение группы крови у новорожденных в этом случае проводится только по наличию антигенов системы АВО.

Помимо ситуаций, связанных с необходимостью переливания крови, определение группы крови, резус-фактора, а также наличия аллоиммунных антиэритроцитарных антител должно проводиться при планировании или во время беременности для выявления вероятности иммунологического конфликта матери и ребенка, который может приводить к гемолитической болезни новорожденных.

Гемолитическая болезнь новорожденных

Гемолитическая желтуха новорожденных, обусловленная иммунологическим конфликтом между матерью и плодом из-за несовместимости по эритроцитарным антигенам. Болезнь обусловлена несовместимостью плода и матери по D-резус- или АВО-антигенам, реже имеет место несовместимость по другим резус-(С, Е, с, d, e) или М-, М-, Kell-, Duffy-, Kidd-антигенам. Любой из указанных антигенов (чаще D-резус-антиген), проникая в кровь резус-отрицательной матери, вызывает образование в ее организме специфических антител. Последние через плаценту поступают в кровь плода, где разрушают соответствующие антигенсодержащие эритроциты.. Предрасполагают к развитию гемолитической болезни новорожденных нарушение проницаемости плаценты, повторные беременности и переливания крови женщине без учета резус-фактора и др. При раннем проявлении заболевания иммунологический конфликт может быть причиной преждевременных родов или выкидышей.

Существуют разновидности (слабые варианты) антигена А (в большей степени) и реже антигена В. Что касается антигена А, имеются варианты: "сильный" А1 (более 80%), слабый А2 (менее 20%), и еще более слабые (А3, А4, Ах - редко). Это теоретическое понятие имеет значение для переливания крови и может вызвать несчастные случаи при отнесении донора А2 (II) к группе 0 (I) или донора А2В (IV) - к группе В (III), поскольку слабая форма антигена А иногда обуславливает ошибки при определении группы крови системы АВO. Правильное определение слабых вариантов антигена А может требовать повторных исследований со специфическими реагентами.

Снижение или полное отсутствие естественных агглютининов альфа и бета иногда отмечается при иммунодефицитных состояниях:

• новообразования и болезни крови - болезнь Ходжкина, множественная миелома, хроническая лимфатическая лейкемия;
• врожденные гипо- и агаммаглобулинемия;
• у детей раннего возраста и у пожилых;
• иммуносупрессивная терапия;
• тяжелые инфекции.

Трудности при определении группы крови вследствие подавления реакции гемагглютинации возникают также после введения плазмозаменителей, переливания крови, трансплатации, септицемии и пр.

Наследование групп крови

В основе закономерностей наследования групп крови лежат следующие понятия. В локусе гена АВО возможны три варианта (аллеля) - 0, A и B, которые экспрессируются по аутосомно-кодоминантному типу. Это означает, что у лиц, унаследовавших гены А и В, экспрессируются продукты обоих этих генов, что приводит к образованию фенотипа АВ (IV). Фенотип А (II) может быть у человека, унаследовавшего от родителей или два гена А, или гены А и 0. Соответственно фенотип В (III) - при наследовании или двух генов В, или В и 0. Фенотип 0 (I) проявляется при наследовании двух генов 0. Таким образом, если оба родителя имеют II группу крови (генотипы AА или А0), кто-то из их детей может иметь первую группу (генотип 00). Если у одного из родителей группа крови A(II) с возможным генотипом АА и А0, а у другого B(III) с возможным генотипом BB или В0 - дети могут иметь группы крови 0(I), А(II), B(III) или АВ (!V).

• Гемолитическая болезнь новорожденных (выявление несовместимости крови матери и плода по системе АВ0);
• Предоперационная подготовка;
• Беременность (подготовка и наблюдение в динамике беременных с отрицательным резус-фактором)

Подготовка к исследованию: не требуется

При необходимости (обнаружение А2-подтипа) проводится дополнительное тестирование с использованием специфических реактивов.

Сроки исполнения: 1 день

Результат исследования:

• 0 (I) - первая группа,
• A (II) - вторая группа,
• B (III) - третья группа,
• AB (IV) - четвертая группа крови.

При выявлении подтипов (слабых вариантов) групповых антигенов результат выдается с соответствующим комментарием, например, "выявлен ослабленный вариант А2, необходим индивидуальный подбор крови".

Резус-фактор Rh

Основной поверхностный эритроцитарный антиген системы резус, по которому оценивают резус-принадлежность человека.

Функции. Антиген Rh - один из эритроцитарных антигенов системы резус, располагается на поверхности эритроцитов. В системе резус различают 5 основных антигенов. Основным (наиболее иммуногенным) является антиген Rh (D), который обычно подразумевают под названием резус-фактор. Эритроциты примерно 85% людей несут этот белок, поэтому их относят к резус-положительным (позитивным). У 15 % людей его нет, они резус-отрицательны (негативны). Наличие резус-фактора не зависит от групповой принадлежности по системе АВ0, не изменяется в течение жизни, не зависит от внешних причин. Он появляется на ранних стадиях внутриутробного развития, и у новорожденного уже обнаруживается в существенном количестве. Определение резус принадлежности крови применяется в общей клинической практике при переливании крови и ее компонентов, а также в гинекологии и акушерстве при планировании и ведении беременности.

Несовместимость крови по резус-фактору (резус-конфликт) при переливании крови наблюдается, если эритроциты донора несут Rh -агглютиноген, а реципиент является резус-отрицательным. В этом случае у резус-отрицательного реципиента начинают вырабатываться антитела, направленные против резус-антигена, приводящие к разрушению эритроцитов. Переливать эритроциты, плазму и особенно цельную кровь от донора к реципиенту нужно строго соблюдая совместимость не только по группе крови, но и по резус-фактору. Присутствие и титр уже имеющихся в крови антител к резус-фактору и других аллоиммунных антител можно определить, указав тест "anti-Rh (титр)".

Определение группы крови, резус-фактора, а также наличия аллоиммунных антиэритроцитарных антител должно проводиться при планировании или во время беременности для выявления вероятности иммунологического конфликта матери и ребенка, который может приводить к гемолитической болезни новорожденных. Возникновение резус-конфликта и развитие гемолитической болезни новорожденных возможно в том случае, если беременная резус-отрицательна, а плод- резус-положителен. В случае, если у матери Rh +, а плод - резус - отрицателен, опасности гемолитической болезни для плода нет.

Гемолитическая болезнь плода и новорожденных - гемолитическая желтуха новорожденных, обусловленная иммунологическим конфликтом между матерью и плодом из-за несовместимости по эритроцитарным антигенам. Болезнь может быть обусловлена несовместимостью плода и матери по D-резус- или АВО-антигенам, реже имеет место несовместимость по другим резус-(С, Е, с, d, e) или М-, N-, Kell-, Duffy-, Kidd-антигенам (по статистике 98% случаев гемолитической болезни новорожденных связаны с D - резус-антигеном). Любой из указанных антигенов, проникая в кровь резус-отрицательной матери, вызывает образование в ее организме специфических антител. Последние через плаценту поступают в кровь плода, где разрушают соответствующие антигенсодержащие эритроциты. Предрасполагают к развитию гемолитической болезни новорожденных нарушение проницаемости плаценты, повторные беременности и переливания крови женщине без учета резус-фактора и др. При раннем проявлении заболевания иммунологический конфликт может быть причиной преждевременных родов или повторных выкидышей.

В настоящее время существует возможность медицинской профилактики развития резус-конфликта и гемолитической болезни новорожденных. Все резус-отрицательные женщины в период беременности должны находиться под наблюдением врача. Необходимо также контролировать в динамике уровень резус-антител.

Есть небольшая категория резус-положительных лиц, способных образовывать анти-резус антитела. Это лица, эритроциты которых характеризуются значительно сниженной экспрессией нормального антигена Rh на мембране ("слабый" D, Dweak) или экспрессией измененного антигена Rh (частичный D, Dpartial). Эти слабые варианты антигена D в лабораторной практике объединяют в группу Du , частота которой составляет около 1%.

Реципиенты, содержание антиген Du, должны быть отнесены к резус-отрицательным и им должна быть перелита только резус-отрицательная кровь, так как нормальный антиген D может вызвать у таких лиц иммунный ответ. Доноры с антигеном Du квалифицируются как резус-положительные доноры, так как переливание их крови может вызвать иммунный ответ у резус-отрицательных реципиентов, а в случае предшествующей сенсибилизации к антигену D - и тяжелые трансфузионные реакции.

Наследование резус-фактора крови.

В основе закономерностей наследования лежат следующие понятия. Ген, кодирующий резус-фактор D (Rh), является доминантным, аллельный ему ген d - рецессивным (резус-положительные люди могут иметь генотип DD или Dd, резус-отрицательные - только генотип dd). Человек получает от каждого из родителей по 1 гену - D или d, и у него возможны, таким образом, 3 варианта генотипа - DD, Dd или dd. В первых двух случаях (DD и Dd) анализ крови на резус фактор даст положительный результат. Только при генотипе dd человек будет иметь резус-отрицательную кровь.

Рассмотрим некоторые варианты сочетания генов, определяющих наличие резус фактора, у родителей и ребенка

• 1) Отец резус - позитивный (гомозигота, генотип DD), у матери резус - отрицательный (генотип dd). В этом случае все дети будут резус - положительными (вероятность 100%).
• 2) Отец резус - позитивный (гетерозигота, генотип Dd), мать - резус- отрицательная (генотип dd). В этом случае вероятность рождения ребенка с отрицательным или положительным резусом одинакова и равна 50 %.
• 3) Отец и мать гетерозиготы по данному гену (Dd), оба резус - позитивны. В этом случае возможно (с вероятностью около 25%) рождение ребенка с отрицательным резусом.

Показания к назначению анализа:

• Определение трансфузионной совместимости;
• Гемолитическая болезнь новорожденных (выявление несовместимости крови матери и плода по резус-фактору);
• Предоперационная подготовка;
• Беременность (профилактика резус-конфликта).

Подготовка к исследованию: не требуется.

Материал для исследования: цельная кровь (с ЭДТА)

Метод определения: Фильтрация проб крови сквозь гель, импрегнированный моноклональными реагентами - агглютинация + гель-фильтрация (карточки, перекрестный метод).

Сроки исполнения: 1 день

Интерпретация результатов:

Результат выдается в форме:
Rh + положительная Rh - отрицательная
При выявлении слабых подтипов антигена D (Du) выдается комментарий: "выявлен слабый резус-антиген (Du), рекомендуется при необходимости переливать резус-отрицательную кровь".

Анти - Rh (аллоиммунные антитела к резус-фактору и другим эритроцитарным антигенам)

Антитела к клинически наиболее важным эритроцитарным антигенам, в первую очередь резус-фактору, свидетельствующие о сенсибилизации организма к этим антигенам.

Функции. Резус-антитела относятся к так называемым аллоиммунным антителам. Аллоиммунные антиэритроцитарные антитела (к резус-фактору или другим эритроцитарным антигенам) появляются в крови при особых условиях - после переливания иммунологически несовместимой донорской крови или при беременности, когда эритроциты плода, несущие иммунологически чужеродные для матери отцовские антигены, проникают через плаценту в кровь женщины. У неиммунных резусотрицательных людей антител к резус-фактору нет. В системе резус различают 5 основных антигенов, основным (наиболее иммуногенным) является антиген D (Rh), который обычно подразумевают под названием резус-фактор. Помимо антигенов системы резус есть еще ряд клинически важных эритроцитарных антигенов, к которым может возникать сенсибилизация, вызывающая осложнения при переливании крови. Метод скринингового исследования крови на присутствие аллоиммунных антиэритроцитарных антител, использующийся в ИНВИТРО, позволяет, помимо антител к резус-фактору RH1(D), выявить в исследуемой сыворотке аллоиммунные антитела и к другим эритроцитарным антигенам.

Ген, кодирующий резус-фактор D (Rh), является доминантным, аллельный ему ген d - рецессивным (резус-положительные люди могут иметь генотип DD или Dd, резус-отрицательные - только генотип dd). Во время беременности резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом возможно развитие иммунологического конфликта матери и плода по резус-фактору. Резус-конфликт может привести к выкидышу или развитию гемолитической болезни плода и новорожденных. Поэтому определение группы крови, резус-фактора, а также наличия аллоиммунных антиэритроцитарных антител должно проводиться при планировании или во время беременности для выявления вероятности иммунологического конфликта матери и ребенка. Возникновение резус-конфликта и развитие гемолитической болезни новорожденных возможно в том случае, если беременная резус-отрицательна, а плод - резус-положителен. В случае, если у матери резус-антиген положительный, а у плода отрицательный, конфликт по резус-фактору не развивается. Частота развития резус-несовместимости составляет 1 случай на 200-250 родов.

Гемолитическая болезнь плода и новорожденных - гемолитическая желтуха новорожденных, обусловленная иммунологическим конфликтом между матерью и плодом из-за несовместимости по эритроцитарным антигенам. Болезнь обусловлена несовместимостью плода и матери по D-резус- или АВО- (групповым) антигенам, реже имеет место несовместимость по другим резус-(С, Е, с, d, e) или М-, М-, Kell-, Duffy-, Kidd-антигенам. Любой из указанных антигенов (чаще D-резус-антиген), проникая в кровь резус-отрицательной матери, вызывает образование в ее организме специфических антител. Проникновению антигенов в материнский кровоток способствуют инфекционные факторы, повышающие проницаемость плаценты, мелкие травмы, кровоизлияния и другие повреждения плаценты. Последние через плаценту поступают в кровь плода, где разрушают соответствующие антигенсодержащие эритроциты. Предрасполагают к развитию гемолитической болезни новорожденных нарушение проницаемости плаценты, повторные беременности и переливания крови женщине без учета резус-фактора и др. При раннем проявлении заболевания иммунологический конфликт может быть причиной преждевременных родов или выкидышей.

Во время первой беременности резус-положительным плодом у беременной с Rh "-" риск развития резус-конфликта составляет 10-15 %. Происходит первая встреча организма матери с чужеродным антигеном, накопление антител происходит постепенно, начиная, приблизительно с 7-8 недели беременности. Риск несовместимости возрастает с каждой последующей беременностью резус - положительным плодом, независимо от того, чем она закончилась (искусственным абортом, выкидышем или родами, операцией при внематочной беременности), при кровотечениях во время первой беременности, при ручном отделении плаценты, а также если роды проводятся путем кесарева сечения или сопровождаются значительной кровопотерей. при переливании резус-положительной крови (в том, случае, если они проводились даже в детском возрасте). Если последующая беременность развивается с резус-отрицательным плодом, несовместимость не развивается.

Всех беременных женщин с Rh "-" ставят на специальный учет в женской консультации и проводят динамический контроль над уровнем резус-антител. В первый раз анализ на антитела надо сдать с 8-й до 20-й недели беременности, и затем периодически проверять титр антител: 1 раз в месяц до 30-й недели беременности, дважды в месяц до 36-й недели и 1 раз в неделю до 36-й недели. Прерывание беременности на сроке менее 6-7 недель может не привести к формированию у матери Rh-антител. В этом случае при последующей беременности, если у плода будет положительный резус-фактор, вероятность развития иммунологической несовместимости вновь будет равна 10-15 %.

Проведение тестирования на аллоиммунные антиэритроцитарные антитела важно также при общей предоперационной подготовке, особенно для людей, которым ранее уже проводилось переливание крови.

Показания к назначению анализа:

• Беременность (профилактика резус-конфликта);
• Наблюдение за беременными с отрицательным резус-фактором;
• Невынашивание беременности;
• Гемолитическая болезнь новорожденных;
• Подготовка к гемотрансфузии.

Подготовка к исследованию: не требуется.
Материал для исследования: цельная кровь (с ЭДТА)

Метод определения: метод агглютинации + гель-фильтрации (карточки). Инкубация стандартных типированных эритроцитов с исследуемой сывороткой и фильтрация путем центрифугирования смеси через гель, импрегнированный полиспецифическим антиглобилиновым реагентом. Агглютинированные эритроциты выявляются на поверхности геля или в его толще.

В методе используются суспензии эритроцитов доноров группы 0(1), типирован-ные по антигенам эритроцитов RH1(D), RH2(C), RH8(Cw), RH3(E), RH4(c), RH5(e), KEL1(K), KEL2(k), FY1(Fy a) FY2(Fy b), JK (Jk a), JK2(Jk b), LU1 (Lu a), LU2 (LU b), LE1 (LE a), LE2 (LE b), MNS1(M), MNS2 (N), MNS3 (S), MNS4(s), P1 (P).

Сроки исполнения: 1 день

При обнаружении аллоиммунных антиэритроцитарных антител проводится их полуколичественное определение.
Результат выдается в титрах (максимальное разведение сыворотки, при котором еще обнаруживается положительный результат).

Единицы измерения и коэффициенты пересчета: Ед/мл

Референсные значения: отрицательно.

Положительный результат: Сенсибилизация к резус-антигену или другим эритроцитарным антигенам.

Группы крови системы АВ0

Группы крови системы АВ0 были открыты в 1900 году К.Ландштейнером, который смешивая эритроциты одних лиц с сывороткой крови других лиц, обнаружил, что при одних сочетаниях кровь свертывается, образуя хлопья (реакция агглютинации), а при других нет. На основании этих исследований Ландштейнер разделил кровь всех людей на три группы: А, В и С. В 1907 году была обнаружена еще одна группа крови.

Было установлено, что реакция агглютинации происходит при склеивании антигенов одной группы крови (их назвали агглютиногенами), которые находятся в красных кровяных тельцах - эритроцитах с антителами другой группы (их назвали агглютининам), находящимися в плазме - жидкой части крови. Разделение крови по системе АВ0 на четыре группы основано на том, что кровь может содержать или не содержать антигены (агглютиногены) А и В, а также антитела (агглютинины) α (альфа или анти-А) и β (бета или анти-Б).

Первая группа крови - 0 (I)

I группа - не содержит агглютиногенов (антигенов), но содержит агглютинины (антитела) α и β. Она обозначается 0 (I). Так как эта группа не содержит инородных частиц (антигенов), то ее можно переливать всем людям. Человек с такой группой крови является универсальным донором.

Вторая группа крови А β (II)

II группа содержит агглютиноген (антиген) А и агглютинин β (антитела к агглютиногену В). Поэтому ее можно переливать только тем группам, которые не содержат антиген В - это I и II группы.

Третья группа крови Вα (III)

III группа содержит агглютиноген (антиген) В и агглютинин α (антитела к агглютиногену А). Поэтому ее можно переливать только тем группам, которые не содержат антиген А - это I и III группы.

Четвертая группа крови АВ0 (IV)

IV группа крови содержит агглютиногены (антигены) А и В, но содержит агглютининов (антител). Поэтому ее можно переливать только тем, у кого такая же, четвертая группа крови. Но, так как в крови таких людей нет антител, способных склеиться с вводимыми извне антителами, то им можно переливать кровь любой группы. Люди с четвертой группой крови являются универсальными реципиентами.

Группы крови по системе АВО

Методика определения групп крови

Групповая принадлежность крови по системе АВО определяется при помощи реакции агглютинации. В настоящее время существует три способа опреде­ления групп крови по системе АВО:

По стандартным изогемагглютинирующим сывороткам;

С помощью моноклональных антител (цоликлонов анти-А и анти-В).

Определение групп крови по стандартным изогемагглютинирующим сывороткам

Суть метода сводится к обнаружению в испыту­емой крови групповых антигенов А и В с помощью стандартных сывороток. Для этих целей использу­ется реакция агглютинации. Пробу нужно делать в помещении с хорошим освещением при темпера­туре 15-25° С.

Для проведения пробы необходимы: - Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки групп О (I), А (II), В (III) и АВ (IV) двух различных се­рий. Сыворотки для определения групп крови изготав­ливают из донорской крови в специальных лаборато­риях. Хранятся сыворотки в холодильнике при темпе­ратуре 4 - 8° С. Срок годности сыворотки указывают на этикетке. На этикетке также указывается титр (то мак­симальное разведение сыворотки, при котором может наступить реакция агглютинации), который должен быть не ниже 1: 32 (для сыворотки В (III) - не ниже 1:16 /32). Сыворотка должна быть прозрачной, без при­знаков гниения. Стандартные сыворотки для удобства подкрашивают в определенный цвет: О (I) - бесцветная (серая), А (II) - синяя, В (III) - красная, АВ (IV) - ярко-желтая. Эти цвета сопутствуют всем этикеткам на пре­паратах крови, имеющих групповую принадлежность (кровь, эритроцитная масса, плазма и др.).

Белые фарфоровые или эмалированные тарел­ки или другие пластинки со смачиваемой поверх­ностью, маркированные, согласно группам крови.

Изотонический раствор хлорида натрия.

Иглы, пипетки, стеклянные палочки (предмет­ные стекла).

Техника проведения реакции.

1. Под соответствующими обозначениями груп­пы крови на тарелку (пластинку) наносят сыворот­ку I, II, III групп в объеме 0,1 мл (одна большая капля диаметром около 1 см). Чтобы избежать оши­бок, наносят две серии сывороток, поскольку одна из серий может иметь низкую активность и не дать четкой агглютинации. Таким образом, получается 6 капель, образующих два ряда по три капли в сле­дующем порядке слева направо: 0 (I), А (II), В (III).

2. Кровь для исследований берут из пальца или из вены. Сухой стеклянной палочкой на пластину в 6 точек последовательно переносят 6 капель иссле­дуемой крови величиной примерно с булавочную го­ловку 0,01 мл (маленькая капля), каждую рядом с каплей стандартной сыворотки. Причем количество сыворотки должно в 10 раз превышать количество исследуемой крови. Затем их осторожно переме­шивают между собой стеклянными палочками с за­кругленными краями.

Возможна и более простая методика: на тарел­ку наносится одна большая капля крови, потом ее забирают оттуда уголком предметного стекла и переносят каждую каплю сыворотки, аккуратно перемешивая ее с последней. При этом кровь каж­дый раз берут чистым уголком стекла, следя за тем, чтобы капли не смешивались.

3. Смешав капли, тарелку периодически покачи­вают. Агглютинация начинается в течение первых 10-30 секунд. Но наблюдение следует вести не ме­нее 5 минут, так как возможна более поздняя агглю­тинация, например с эритроцитами группы А 2 (II).

4. В те капли, где произошла реакция, добавляют по одной капле изотонического раствора хлорида натрия, после чего оценивают результаты реакции.

Реакция агглютинации может быть положитель­ной или отрицательной

При положительной реакции в течение первых 10-30 секунд наблюдают в смеси видимые невоору­женным глазом мелкие красные зернышки (агглю-тинаты), состоящие из склеенных эритроцитов. Мел­кие зернышки постепенно сливаются в более круп­ные зерна или даже в хлопья неправильной формы. При отрицательной реакции капля остается равно­мерно окрашенной в красный цвет.

Результаты реакций двух серий в каплях с сыво­роткой одной и той же группы должны совпадать.

Принадлежность исследуемой крови к соответству­ющей группе определяют по наличию или отсутствию агглютинации при реакции с соответствующими сы­воротками.

Если все сыворотки дали положительную реакцию, значит, испытуемая кровь содержит оба агглютиногена - А и В. Но в таких случаях, чтобы исключить неспецифическую реакцию агглютинации, следует провести дополнительное контрольное исследование испытуемой крови со стандартной сывороткой группы АВ (IV).

Определение групп крови моноклональными антителами

Для определения групп крови этим способом используют моноклинальные антитела, которые по­лучают с помощью гибридомной, биотехнологии.

Гибридома - это клеточный гибрид, образованный путем слияния клетки костного мозга (миеломы) с иммунным лимфоцитом, который синтезирует спе­цифические моноклональные антитела. Гибридома обладает способностью к неограниченному росту, ха­рактерна для опухолевой клетки и присущей лим­фоциту способностью синтезировать антитела.

Разработаны стандартные реагенты-моноклональные антитела (МКА): цоликлоны анти-А и анти-В, при­меняемые для определения агглютиногенов эритроци­тов. Цоликлоны представляют собой лиофилизированный порошок красного (анти-А) и синего (анти-В) цвета, который разводят изотоническим раствором хлорида натрия непосредственно перед пробой.

Техника проведения.

Цоликлоны анти-А и анти-В наносят на белый планшет по одной большой капле (0,1 мл) под соот­ветствующими надписями: анти-А или анти-В. Ря­дом с каплями антител следует нанести по одной маленькой капле исследуемой крови. После переме­шивания компонентов наблюдают за реакцией агг­лютинации в течение 2-3 минут. Оценка результа­тов очень проста.

Определение групповой принадлежности крови может сопровождаться ошибками, которые ведут к неправильной трактовке результатов. Можно выде­лить три основные группы ошибок: ошибки, свя­занные с низким качеством реагентов; техничес­кие ошибки; ошибки, связанные с особенностями Схема оценки результатов определения групп крови спомощью моноклональных антител(цоликлоны анти-А и анти-В)исследуемой крови. Первых двух можно избежать, строго соблюдая описанные выше требования к сыво­ротке, условиям проведения реакции и др. Третья группа связана с явлением неспецифической панагглютинации (феномен Томсена), сущность которого состоит в том, что сыворотка при комнатной темпера­туре дает агглютинацию со всеми эритроцитами, даже со своими собственными (аутоагглютинация), а эрит­роциты в то же время дают агглютинацию со всеми сыворотками, даже с сывороткой группы АВ. Подоб­ное явление описано при ряде заболеваний: болезнях крови, спленомегалии, циррозе печени, инфекционных заболеваниях и др. Описана также панагглютинация и аутоагглютинация у здоровых людей.

Явление панагглютинации и аутоагглютинации наблюдается только при комнатной температуре. Если определение групповой принадлежности про­водить при температуре 37° С, они исчезают.

Нужно строго помнить, что во всех случаях не­четкого или сомнительногскрезультата следует про­вести повторное определение групп крови при по­мощи стандартных сывороток других серий, а так­же перекрестным способом.

66. Методы определения групп крови по системам аво и резус.

Для проведения исследования необходимы стандартные гемагглютинирующие сыворотки I (О), II (А), III (В), IV (АВ), причем первые три варианта сыворотки должны быть представлены двумя сериями.

Сыворотка должна быть пригодной для использования, для этого обязательно проверяют соответствие ее сроку годности, указанному на этикетке сыворотки, определяют визуально ее состояние. Нельзя использовать сыворотку, если она является мутной, содержит посторонние примеси, хлопья, взвесь, изменила цвет.

Сыворотка считается пригодной для использования, если она является прозрачной, ампула имеет этикетку, на которой указаны основные ее свойства (серия, срок годности, групповая принадлежность, цветная маркировка соответственно групповой принадлежности), ампула не повреждена, не вскрыта.

Необходимы чистая тарелка, которую необходимо разделить на четыре части, отметив соответствие каждой определенной группе крови, игла-скарификатор, стерильные ватные тампоны, чистое сухое обезжиренное предметное стекло, спирт. На тарелку в соответствии с маркировкой наносят по капле каждой сыворотки. Затем кожу подушечки четвертого пальца левой руки обрабатывают стерильным ватным тампоном со спиртом. С помощью скарификатора прокалывают кожу, удаляя первую выступившую каплю крови (примесь к ней спирта и тканевой жидкости может исказить результаты исследования). Следующую каплю крови забирают уголком предметного стекла, для каждой капли сыворотки – чистым уголком стекла. Для исследования к капле гемагглютинирующей сыворотки добавляют каплю крови в соотношении 10: 1. Затем, аккуратно поворачивая и покачивая тарелку, производят перемешивание крови. Агглютинация обычно выявляется в виде выпадения хлопьев, которые хорошо визуализируются. Для уточнения результата к капле добавляют изотонический раствор хлорида натрия, после чего с достаточной достоверностью оценивают результат.

Одним из обязательных условий проведения исследования является соблюдение температурного режима.

Оптимальной является температура 20 – 25 оС, поскольку уже ниже 15 оС отмечается холодовая агглютинация, резко нарушающая специфичность данной пробы, а при температуре окружающей среды выше данного интервала скорость реакции агглютинации резко замедляется.

Если гемагглютинация происходит в капле с сыворотками I (О), III (В), но не происходит с сывороткой II (А), причем результат аналогичен с сыворотками двух сывороток, это означает, что исследуемая кровь принадлежит III (B) группе по системе АВО.

Если гемагглютинация происходит в капле с сыворотками I (О), II (А), но не происходит с сывороткой III (В), это означает, что исследуемая кровь принадлежит II (А) группе по системе АВО.

Но возможна и такая ситуация, когда гемагглютинация не происходит ни с одной из исследуемых сывороток, причем обеих серий. Это означает, что исследуемая кровь не содержит агглютиногенов и принадлежит к I (О) группе по системе АВО.

Если же агглютинация происходит со всеми сыворотками, причем обеих серий, это означает, что исследуемая сыворотка содержит оба агглютиногена (А и В) и принадлежит к IV (АВ) группе по системе АВО.

Экспресс-метод определения групповой принадлежности крови по системе резус. Для исследования необходимо иметь стандартную антирезусную сыворотку, принадлежащую IV (АВ) группе по системе АВО, чашку Петри, изотонический раствор хлорида натрия, 30%-ный раствор реополиглюкина, чистое сухое обезжиренное предметное стекло. Вначале необходимо развести стандартную антирезусную сыворотку раствором реополиглюкина и нанести ее каплю на чашку Петри. Кроме того, на чашку Петри наносят каплю сыворотки IV (АВ) группы, которая не содержит антител. Забор крови производят аналогично способу, описанному при определении системы АВО. Каплю крови забирают с помощью угла предметного стекла, добавляют к капле сыворотки и аккуратно перемешивают. Другим углом забирают каплю для добавления к другой сыворотке и также перемешивают. Предварительный результат оценивают через 4 мин, затем к каждой капле необходимо добавить каплю изотонического раствора хлорида натрия, через 2 мин оценивается окончательный результат. Если в обеих каплях не наблюдается выпадения хлопьев агглютинации, это свидетельствует о том, что исследуемая кровь резус-отрицательная. Если же агглютинации произошла с обеими сыворотками, результат исследования нельзя считать достоверным. Наконец, если агглютинация произошла с антирезусной сывороткой, но не произошла с другой, контрольной, кровь считается резус-положительной.

67. Современные правила переливания крови по группам системы АВО и системы резус. Обязанности врача, переливающего кровь

Необходимость инфузии крови или её компонентов, а также выбор метода и определение дозировки переливания, определяются лечащим врачом на основании клинических симптомов и биохимических проб. Врач, осуществляющий переливание, обязан вне зависимости от данных предыдущих исследований и анализов, лично произвести следующие исследования: определить группу крови больного по системе ABO и сравнить полученные данные с историей болезни; определить группу крови донора и сравнить полученные данные с информацией на этикетке контейнера; проверить совместимость крови донора и больного; получить данные биологической пробы. Запрещается трансфузия крови и её фракций, не прошедшей анализы на СПИД, сывороточный гепатит и сифилис. Гемотрансфузия осуществляется с соблюдением всех необходимых асептических мер. Допускается инфузия крови или её фракций исключительно при совпадении резус-фактора донора и реципиента. В случае необходимости возможна инфузия резус-отрицательной крови первой группы человеку с любой группой крови в объёме до 0,5 л (только взрослым). Резус-отрицательную кровь второй и третьей группы можно трансфузировать человеку со второй, третьей и четвертой группой, вне зависимости от резус-фактора. Человеку с четвертой группой крови положительного резус-фактора можно переливать кровь любой группы. Эритроцитную массу резус-положительной крови первой группы можно инфузировать пациенту с любой группой при резус-положительном факторе. Кровь второй и третьей группы с резус-положительным фактором можно инфузировать человеку с четвертой резус-положительной группой. Так или иначе, перед трансфузией обязательно проведение теста на совместимость. При обнаружении в крови иммуноглобулинов редкой специфики необходим индивидуальный подход к выбору крови и проведение специфических тестов на совместимость.

Пробы на совместимость крови донора и реципиента перед переливанием.

Наконец, если выяснено, что кровь донора и кровь реципиента совпадают по системам АВО и резусу, для переливания необходимо произвести биологическую пробу на совместимость. Ее проводят с самого начала переливания крови. Подсоединив систему для переливания крови, открывают зажим и вводят примерно 20 мл крови донора струйно, затем зажим закрывают и внимательно наблюдают за реакцией пациента в течение 3 мин. Биологическая несовместимость крови донора и пациента в клинической практике встречается нечасто, но может быть очень опасной для здоровья реципиента. О наличии ее можно говорить, если наблюдаются гиперемия лица, психомоторное возбуждение, пациент стремится встать, могут отмечаться неадекватное поведение, тахикардия и тахипноэ, снижение артериального давления. Учащение дыхания может сочетаться с ощущением нехватки воздуха. Подобная реакция является абсолютным противопоказанием для переливания данному реципиенту крови данного донора. Однако это не исключает использования других порций донорской крови от данного лица другим пациентам. Если проведение биологической пробы не сопровождается появлением подобной реакции при повторении ее дважды, она считается пригодной для переливания. Трансфузию продолжают, однако в течение всего времени необходимо тщательно наблюдать за состоянием реципиента, его артериальным давлением, температурой тела, общим состоянием, частотой и ритмом дыхания, оценивать частоту и качество пульса, обращать внимание на субъективные ощущения пациента: чувство жара, ощущение нехватки воздуха, кожный зуд, боли в области поясницы, озноб и др. Подобный мониторинг состояния больного проводится в течение 4 ч после переливания крови, и если через это время реакции на переливание не отмечается, то проведенная гемотрансфузия считается успешной, проведенной без осложнений.

Определение группы крови системы АВ0

Используют стандартные сыворотки I II III IV группы крови 2-х серий.

Надеть передник, маску, очки, перчатки, нарукавники.

Методика проведения.

1. На чистую, сухую, обезжиренную тарелку капают по одной капле стандартных сывороток 2-х серий (6 капель). Каждая сыворотка капается отдельной пипеткой. Пипетки маркируются и находятся во флаконах с физ.раствором.

2. Рядом с каплей стандартной сыворотки палочкой или отдельной пипеткой наносится капля крови (соотношение сыворотка-кровь 10:1).

3. Капли тщательно перемешиваются отдельными палочками.

4. Покачивают тарелку и наблюдают результаты в течение 5минут. По истечению 3минут для исключения ложной агглютинации вносят по капле физ.раствора и продолжают наблюдение.

Определение результатов.

Сыворотки всех групп не дали реакции-исследуемая кровь относится к группе 0(I)

Сыворотки групп 0 (I) и В (III) дали положительную реакцию, сыворотка групп А (II) агглютинацию эритроцитов не вызывала – исследуемая кровь относится к группе А (II)

Сыворотки групп О(I) и А (II) дали положительную реакцию, сыворотка группы В (III) не дала реакцию – кровь отосится к группе

Сыворотки всех групп дали положительную реакцию – кровь можно отнести к группе АВ (IV) . нотолько в том случае, если при проведении контроля исследуемых эритроцитов со стандартной сывороткой группы АВ (IV) реакции агглютинации не будет. Положительная агглютинация с сывороткой АВ (IV)означает наличие неспецифической агглютинации.

Определение группы крови системы АВО моноклональными антителами .

Это современный метод определения группы крови АВО моноклональными реагентами(цоликлонами анти-А и анти-В).

Методика определения: Надеть передник, маску, перчатки, нарукавники

1. на тарелку в две ячейки капают по 1 каплецоликлоны анти-А и анти-В

2. Рядом с каплями антител наносят исследуемую кровь в соотношении сыворотка –кровь 10:1.

3. Смешивают реагенты отдельными стеклянными палочками.

4. Наблюдают за результатом 2,5 минут.

Определение результатов:

Агглютинации нет ни с цоликлоном анти-А, ни с цоликлоном анти-В-

кровь принадлежит к группе О(I)

Агглютинация наблюдается только с цоликлоном анти-А- кровь принадлежит к группе А (II)

Агглютинация наблюдается только с цоликлоном анти-В – кровь принадлежит к группе В (III)

Агглютинация наблюдается как с цоликлоном анти-А, так и с цоликлоном анти-В – кровь принадлежит к группе АВ (IV)

5. Пробы перед переливание крови .

Надеть маску, очки, передник, перчатки.

Из вены больного берут 5мл крови, центрифугируют и получают сыворотку.

А) Проба на индивидуальную совместимость: наносят 2-3 капли сыворотки на планшетку и добавляют каплю крови донора (10:1). Кровь смешивают с сывороткой сухой стеклянной палочкой, планшетку слегка покачивают и наблюдают за результатом.

Результат: отсутствие агглютинации-кровь совместима, есть агглютинация – кровь не совместима.

Б) Проба на резус-совместимость:

Написать на чистой пробирке фамилию, имя, отчество рецепиента и его группу крови, а так же номер флакона донора.

Внести на дно пробирки пастеровской пипеткой 2 капли сыворотки рецепиента, 1 каплю крови донора и 1 каплю 33% р-ра полиглюкина.

Перемешайте полученную в пробирке смесь и, наклоняя пробирку до горизонтального положения, поворачивайте ее таким образом, чтобы содержимое растекалось по стенкам пробирки в нижней ее трети.

По истечении 5 минут долейте в пробирку2-3 мл изотонического раствора натрия хлорида и перемешайте содержимое путем 2-3 кратного переворачивания пробирки.

Результат:

1. Наличие агглютинации эритроцитов – кровь донора несовместима с кровью больного.

2. Нет признаков агглютинации – кровь совместима.

В) Биологическая проба.

Техника проведения:

Струйно переливать 10-15мл крови (эритроцитарной массы, плазмы), затем в течение 3-х минут наблюдать за больным. При отсутствии клинических проявлений реакции или осложнений (учащения пульса, дыхания, появления одышки, затрудненного дыхания и гиперемии лица ит.д.) вводят вновь 10-15 мл крови (эритроцитарной массы, плазмы и т. д.) и в течение 3-х минут наблюдают за больным. Такую же процедуру повторяют и в 3-й раз. Отсутствие реакции у больного после 3-х кратной проверки, является основанием для продолжения трансфузии. 10-15 мл крови оставляют во флаконе и хранят 1сутки в холодильнике.

6.После переливания крови реципиент в течение 2-часов соблюдает постельный режим и наблюдается врачом. Ежечасно ему измеряют температуру тела, АД, фиксируют эти показания в истории болезни. Контролируется наличие мочевыделения и нормального цвета мочи. На следующий день после переливания обязательно производят общий анализ мочи и крови. Записывается в историю болезни показание к гемотрансфузии и оформляется протокол переливания, содержащий следующие сведения:

– Ф.И.О больного

Группа крови и резус-принадлежность больного

Паспортные данные флаконов крови или компонентов, фамилию и инициалы донора, группу и резус-принадлежность крови, номер флакона, дату заготовки.

Результат контрольного определения группы крови больного

Результаты контрольного определения группы каждого флакона крови и ее компонентов.

Результаты проб на совместимость крови доноров и реципиента при комнатной температуре

Метод и результаты проб на совместимость при температуре

Результаты биологических проб

Состояние больного во время и после трансфузии.

/ 29

29 Методы определения групп крови и резус-фактора. Профилактика возможных ошибок

Определение групп крови с помощью стандартных сывороток. В лунки планшета для определения групп крови последовательно наносят пипетками по одной крупной капле стандартной сыворотки групп 0(1), А(П), В(Ш) двух различных серий каждой группы. Затем наносят в каждую лупку по капле исследуемой крови, в 5 - 10 раз меньшую сыворотки. Сухими стеклянными палочками или путем покачивания планшета смешивают стандартные сыворотки и исследуемую кровь. Через 5 минут оценивают результат (табл. 2).

Таблица 2

Определение групп крови с помощью стандартных сывороток

Группа исследуемой крови	Стандартные сыворотки

Определение групп крови по стандартным эритроцитам. В лунки планшета наносят большие капли плазмы исследуемой крови. Рядом с каждой каплей плазмы последовательно наносят по небольшой капле стандартных эритроцитов групп 0(1), А(II), В(III). Капли перемешивают покачиванием планшета. Через 5 минут к каждой капле смеси добавляют по 1 капле физиологического раствора и учитывают результат.

Таблица 3

Определение групп крови с помощью стандартных эритроцитов

Группа исследуемой крови	Стандартные эритроциты

Определение резус-фактора. На дно сухой пробирки наносят 1 большую каплю универсального реагента анти-резус, затем добавляют такую же каплю исследуемой крови. После встряхивания пробирки производят перемешивание сыворотки анти-резус и крови в течение 5 минут по стенкам пробирки, после чего добавляют 5 - 7 мл физиологического раствора. Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии резус-фактора.

Определение групп крови с помощью цоликлонов. Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ предназначены для определения групп крови человека системы АВО в прямых реакциях гемагглютинации и применяются взамен или параллельно с поликлональными иммунными сыворотками.

Моноклональные анти-А и анти-В антитела продуцируются двумя мышиными гибридомами и принадлежат к иммуноглобулинам класса М. Цоликлоны изготовляются из асцитной жидкости мышей-носителей анти-А и анти-В гибридом. Цоликлон анти-АВ представляет собой смесь моноклональных анти-А и анти-В антител.

Цоликлоны выпускаются в жидкой форме во флаконах объемом 5 - 10 мл. Цоликлон анти-А - желтого цвета, анти-В - синего, анти-АВ - бесцветный. В качестве консерванта применяется азид натрия.

Техника определения групп крови. Определение производится в нативной крови, взятой в консервант; в крови, взятой без консерванта, в том числе из пальца. Используется метод прямой гемагглютинации на пластине или планшете, определение производится в помещении с хорошим освещением при температуре 15 - 25 X.

Наносят на пластину или планшет индивидуальными пипетками цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями.

Рядом с каплями антител наносят по одной маленькой капле исследуемой крови (0,01 - 0,03 мл).

Смешивают кровь с реагентом, покачивая планшет.

Наблюдают за ходом реакции с цоликлонами визуально при легком покачивании планшета в течение 3 минут. Агглютинация эритроцитов с цоликлонами обычно наступает в первые 3 - 5 секунд, но наблюдение следует вести 3 минуты ввиду более позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности антигенов А или В.

Результат реакции в каждой капле может быть положительным или отрицательным. Положительный результат выражается в агглютинации (склеивании) эритроцитов. Агтлютинаты видны в виде мелких красных агретатов, быстро смешивающихся в крупные хлопья. При отрицательной реакции капля остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней не обнаруживаются.

Интерпретация результатов реакции агглютинации с цоликлонами представлена в табл. 4.

Таблица 4

Определение групп крови с помощью цоликлонов

Группа исследуемой крови	Стандартные эритроциты

Примечание: знаком (+) обозначено наличие агглютинации, знаком (-) - се отсутствие

При положительном результате реакции агглютинации со всеми гремя цоликлонами необходимо исключить спонтанную неспецифическую аглютинацию исследуемых эритроцитов. Для этого смешивают на плоскости 1 каплю исследуемых эритроцитов с каплей физиологического раствора. Кровь можно отнести к группе AB(IV) только при отсутствии агглютинации эритроцитов в физиологическом растворе.

Определение резус-фактора с помощью цоликлона. В лупку планшета наносят 1 большую каплю цоликлона анти-Д-супер т рядом наносят 1 маленькую каплю исследуемой крови.

Покачивая планшет, смешивают кровь с цоликлоном. За ходом реакции наблюдают в течение 3 минут. Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии резус-фактора.

Почему возникает конфликт «мать-плод»?
Конфликт «мать- плод» возникает при несовместимости крови матери и плода, когда в крови матери образуются антитела, повреждающие эритроциты плода, что приводит к гемолитической болезни новорожденного. В основе этого явления лежит различие крови человека по группам в зависимости от наличия в эритроцитах разных антигенов, а в плазме - общегрупповых антител. Число групповых антигенов большое, и они определяют группу крови. Ребенок получает систему группы крови от отца и матери, согласно закону Менделя. Практически определить группу нетрудно. Не все антигены одинаково распространены и одинаково сильны, поэтому не все вызывают серологический конфликт. Чаще всего возникает несовместимость по резус-фактору и АВ0-системе.

Конфликт по системе АВО

Изоиммунизация может развиться в результате несовместимости крови матери и плода по системе АВО, Когда у матери О(I) группа крови, а у плода любая другая. Антигены А и В плода могут проникать во время беременности в кровоток матери, приводя к выработке иммунных альфа- и бетта- антител соответственно и развитию у плода реакции
антиген-антитело. Групповая несовместимость матери и плода хотя и встречается чаще, чем несовместимость по резус фактору, гемолитическая болезнь плода и новорожденного при этом протекает легче и, как правило, не требует интенсивной терапии.

Почему происходит иммунологический конфликт?

Первая группа крови не содержит в эритроцитах антигенов А и В, зато имеются антитела α и β. Во всех остальных группах такие антигены есть и поэтому первая группа крови, встретившись с чужеродными для нее антигенами А или В начинает с ними «вражду», разрушая эритроциты содержащие в себе эти антигены. Именно этот процесс и является иммунологическим конфликтом по системе АВ0.

Немного физиологии.

Давайте разберемся, что такое группа крови и почему такой конфликт во время беременности может возникать. Вспомним школьную биологию. Кровь состоит из клеток крови (эритроцитов, лейкоцитов) и плазмы (жидкой части). Эритроциты выглядят как красные двояковогнутые диски.
В эритроците находится огромное количество гемоглобина - сложного белка, который может переносить кислород. Подсчитано, что каждый эритроцит содержит более 3 миллионов молекул гемоглобина.

Также на поверхности эритроцитов могут располагаться специальные белки, так называемые агглютиногены. Их наличие у каждого человека индивидуально. Если эритроциты, на которых есть определенные агглютиногены, попадают в организм человека, у которого таких агглютиногенов нет, он воспринимает их как чужеродные и вырабатывает против них специальные антитела - агглютинины. Предназначение таких антител - разрушение чужеродных эритроцитов. Приблизительно такая ситуация возникает при конфликте групп крови мамы и ребенка во время беременности. То же происходит и при переливании несовместимой крови.

Агглютиногенов на самом деле огромное количество, но в практической медицине обычно определяют всего несколько. Это агглютиногены A, B, и D. Именно по наличию этих агглютиногенов и судят о группе крови человека:

I группа - на эритроцитах нет агглютиногенов А и В.

II группа - на эритроцитах есть агглютиноген А.

III группа - на эритроцитах есть агглютиноген В.

IV группа - на эритроцитах есть агглютиногены А и В.

А агглютиноген D определяет резус-фактор. Если он есть на эритроцитах - кровь считается резус-положительной, а если нет - резус-отрицательной.

Кому стоит опасаться возникновения конфликта по группе крови?

Теоретически такая проблема может возникнуть в том случае, если у матери с будущим малышом оказываются разные группы крови:

• женщина с I или III группой крови - плод со II;
• женщина с I или II группой крови - плод с III;
• женщина с I, II или III группой - плод с IV.

Самым опасным сочетанием считается, если женщина с I группой крови вынашивает ребенка со II или III. Именно такой расклад чаще всех остальных приводит к развитию всех признаков конфликта у матери с плодом и возникновению гемолитической болезни у новорожденного. В группу риска также входят женщины:

• получавшие в прошлом переливание крови;
• пережившие несколько выкидышей или абортов;
• родившие ранее ребенка, у которого развилась гемолитическая болезнь или отставание психического развития.

Возможность развития группового иммунологического конфликта по системе АВ0 существует у семейных пар имеющих следующие сочетания групп крови:

• женщина с I группой + мужчина со II, III или IV;
• женщина со II группой + мужчина с III или IV;
• женщина с III + мужчина со II или IV.

Что способствует развитию конфликта?

От развития конфликта по группам крови защищает правильно функционирующая и здоровая плацента. Её особенное строение не позволяет крови матери и плода смешиваться, в частности, благодаря плацентарному барьеру. Однако это все-таки может произойти при нарушении целостности сосудов плаценты, её отслойке и других повреждениях или, что чаще всего, во время родов. Попавшие в материнское кровяное русло клетки плода, в случае их чужеродности, вызывают выработку антител, которые обладают возможностью проникновения в организм плода и атаки клеток его крови, вследствие чего происходит гемолитическая болезнь. Токсическое вещество билирубин, образующееся в результате такого воздействия в больших количествах, способно повреждать органы ребенка, в основном мозг, печень и почки, что может грозить серьезными последствиями для физического и умственного здоровья малыша.

Проявления группового конфликта, его лечение и профилактика

Беременная женщина не будет ощущать никаких признаков развития конфликта по группам крови. Узнать о его возникновении поможет анализ крови, который покажет высокий титр антител в крови женщины. При развитии гемолитической болезни плода и новорожденного могут наблюдаться:

• отеки,
• желтушность,
• анемия,
• увеличение селезенки и печени.

Профилактикой серьезных осложнений является регулярная сдача крови на анализ и выявление в ней специфических антител - гемолизинов. В случае их нахождения беременная женщина попадает под наблюдение. Если в результате повторных анализов титр антител продолжит неуклонно расти, а состояние плода ухудшаться, то может потребоваться преждевременное родоразрешение или внутриутробное переливание крови плоду.
Сенсибилизация по системе АВО не является большой проблемой. Важно знать о ней, дважды за беременность проверять титр антител и не перенашивать беременность, так как именно запоздалые роды дают самые тяжелые формы ГБН, требующие заменного переливания крови.

Некоторые врачи-гинекологи регулярно назначают беременным женщинам с первой группой крови анализ на групповые антитела в том случае, если для этого имеются предпосылки. На деле это происходит очень редко, по причине того, что конфликт по системе АВ0 обычно не влечет за собой серьезных последствий и вызывает желтуху только уже у рожденного ребенка, практически не влияя на плод в утробе. Поэтому здесь не существует таких массовых исследований как при беременности резус-отрицательной женщины.

В конфликте по системе АВО плод не болеет, а у новорожденного нет анемии. Однако проявления желтухи в первые дни жизни очень тяжелые и многие дети требуют лечения.
В большинстве случаев гемолитическая болезнь новорожденных о системе АВО не повторяется у последующих детей, (то есть повторные беременности протекают как правило легче- в отличие от резус -сенсибилизации) , но и исключать ее (ГБН) нельзя.Поскольку жизни плода угрозы нет, массовая диагностика АВО-конфликта у беременных не проводится.

Отличительной особенностью иммуноконфликта по системе АВО является более позднее появление признаков гемолитической болезни у новорожденного. Как правило, только на 3-6-й день жизни начинает появляться желтушное окрашивание кожи ребенка, что нередко констатируется как физиологическая желтуха, и только при тяжелых формах гемолитической болезни, которая наблюдается в одном случае на 200-256 родов, своевременно устанавливают правильный диагноз. Такие несвоевременно диагностируемые формы гемолитической болезни новорожденных по системе АВО нередко оставляют последствия у детей.

Гемолитическая болезнь новорожденного требует обязательного лечения во избежание развития тяжелых осложнений. Чем ярче выражены симптомы, тем интенсивнее конфликт, для подтверждения которого проводят анализ крови на повышенное содержание билирубина. Смысл лечения заключается в удалении из крови ребенка антител, поврежденных эритроцитов и излишнего билирубина, для чего проводится фототерапия и другое симптоматическое лечение. В том случае, если это не помогает, или уровень билирубина в крови растет очень быстро, то прибегают к процедуре переливания крови новорожденному.

Будущим родителям, попадающим под риск развития такого конфликта, необходимо знать, что, во-первых, вероятность возникновения реального конфликта по группам крови на практике очень мала, а во-вторых, он чаще всего протекает гораздо легче резус-конфликта, и случаи тяжелого течения сравнительно редки, поэтому конфликт по системе АВ0 считается менее опасным для здоровья малыша.

Процедура определения групп крови по системе АВО заключается в выявлении антигенов А и В в эритроцитах с помощью стандартных антител и использованием агглютининов в плазме или сыворотке анализируемой крови стандартными эритроцитами. Методика разработана в начале XX века и до сих пор активно применяется в медицине. Определение антигенов А и В осуществляется благодаря цоликлонам анти-А и анти-В.

Основные понятия

У доноров всегда определяются не только антигены в эритроцитах, но и агглютинины в сыворотке (плазме) с применением стандартных эритроцитов. В качестве биоматериала используется венозная кровь. Перед исследованием необходимо отказаться от жирной пищи за сутки до анализа и не курить за полчаса до сдачи теста. Группы крови определяют дважды: сначала в лечебном отделении, где заготавливается материал, а затем подтверждают исследованием в лаборатории.

Определение групп крови по системе АВО является основным тестом, который используется в трансфузиологии. Также подобная система групп крови есть у некоторых животных, например у шимпанзе, горилл и бонобо.

История открытия

В науке существует общепринятое мнение о том, что методика определения групп крови по системе АВО была выявлена впервые Карлом Ландштейнером, австрийским учёным, в 1900 году. Тогда он описал в своём труде три типа антигенов. За это через тридцать лет ему была присуждена Нобелевская премия по медицине и физиологии. Из-за того, что между учёными раньше не было тесных связей, позже установили, что чешский врач-серолог Ян Янский независимо от изысканий К. Ландштейнера впервые описал четыре группы крови человека, но его исследования были не известны широкой аудитории. В настоящее время именно классификация, разработанная Я. Янским, применяется в России и республиках бывшего СССР. В США У. Л. Мосс создал свою похожую работу в 1910 г.

Методика определения групп крови по системе АВО с помощью цоликлонов

Группа крови должна определяться в помещении с хорошим освещением с соблюдением диапазона температуры от 15 до 25 градусов Цельсия, так как отклонения от этой нормы могут повлиять на результаты исследования. На пластинке или тарелке пишутся инициалы и фамилия пациента. Слева направо или по кругу наносят стандартные обозначения групп (О(I), A(II), В(III)). Под ними размещают по капле соответствующие сыворотки отдельными пипетками для каждого вида. Затем к ним добавляется кровь пациента. Материал для исследования берется из мочки уха или пальца. Этого требует техника определения группы крови по системе АВО.

Правомерно также использование эритроцитов, находящихся в пробирке после того, как образовался сгусток. Нужно, чтобы количество сыворотки было больше количества добавленной крови в десять раз. После этого капли перемешиваются стеклянными палочками (отдельно для каждой). В течение пяти минут, аккуратно покачивая пластинку, смотрят за появлением реакции гемагглютинации. Она обнаруживается в том, что появляются маленькие красные комочки, сливающиеся затем в более крупные. Сыворотка в это время практически полностью теряет цвет.

Для того чтобы устранить ложную гемагглютинацию простого склеивания эритроцитов, нужно через три минуты добавить одну каплю физиологического раствора и проверить, сохраняется ли агглютинация. Если да, то она является истинной. Все, определение групп крови по системе АВО на этом завершено.

Толкование результатов

В результате могут наблюдаться четыре реакции:

• не происходит агглютинация ни с одной из сывороток - первая группа О(I);
• реакция проявилась с сыворотками I(ab) и III(a) - вторая группа А(II);
• агглютинация наступает с сыворотками I(ab) и II(b) - третья группа В(III);
• если реакция происходит с тремя сыворотками, нужно провести дополнительную процедуру с реактивами группы АВ(IV), которые являются стандартными; если агглютинация в такой капле отсутствует, можно считать, что это 4-я группа крови АВ(IV).

Экспресс-метод для резус-фактора

Методика определения групп крови по системе АВО предполагает одновременное выявление резус-фактора (Rh).

Поверхность пластинки предварительно смачивают и пишут на ней «контрольная сыворотка» и «сыворотка антирезус». Затем под надписями располагают одну-две капли нужных реактивов и добавляют к ним анализируемый материал. Для этого также можно использовать кровь из пальца (в таком же количестве, как и объём сыворотки) или эритроциты, оставшиеся на дне пробирки после появления сгустка (половина объёма сыворотки). Выбор материала на конечный результат не влияет. Затем кровь и сыворотка перемешиваются сухой стеклянной палочкой, после чего в течение пяти минут ожидают наступления реакции. Для того чтобы устранить ложные показания, через три-четыре минуты добавляют изотонический раствор натрия хлорида (всего несколько капель). Определение группы крови по системе АВО и Rh проводится очень часто.

Если агглютинация эритроцитов в капле с сывороткой происходит, это указывает на положительный резус крови. По статистике Rh+ встречается у 85 % населения планеты. Отсутствие её позволяет говорить о резус-отрицательной принадлежности. Если агглютинация появилась в контрольной сыворотке, значит она пришла в негодность. К сожалению, алгоритм определения группы крови по системе АВО не всегда срабатывает идеально.

Какие ошибки могут быть допущены при данной методике?

Неточности при определении принадлежности крови той или иной группе зависят от следующих причин:

• Технических.
• Биологической специфики исследуемой крови.
• Неполноценного характера стандартных сывороток и эритроцитов.

Технические ошибки

Возможные погрешности при определении группы крови системы АВО перекрестным способом:

Ошибки биологической специфики

Погрешности, связанные с биологической спецификой анализируемой крови, делятся на два типа.

• Зависящие от особенностей эритроцитов.
• Ошибки, обусловленные биологическими особенностями сыворотки.

Рассмотрим каждый вид более подробно.

Зависящие от особенностей эритроцитов

• Поздняя агглютинация, объясняющаяся «слабыми» формами эритроцитов и антигенов. Для того чтобы избежать ошибок, определять группу крови доноров и реципиентов нужно с использованием стандартных эритроцитов. Индентифицировать агглютиноген А 2 следует повторным исследованием с другими видами реагентов и другой посуды, увеличив время регистрации реакции.
• «Панагглютинация» («аутоагглютинация») - умение крови проявлять одинаковую реакцию неспецифического характера со всеми сыворотками, в том числе с собственной. Через пять минут острота такой агглютинации слабеет, хотя должна усиливаться. Подобные случаи наблюдаются у онкобольных, обожжённых и др. В качестве контроля необходимо оценить проявление агглютинации анализируемых эритроцитов в стандартной сыворотке четвёртой группы и физрастворе. При «панагглютинации» группу крови определяют в результате тройного отмывания эритроцитов. Если оно не даёт нужного результата, стоит произвести повторный забор образца крови в согретую перед процедурой пробирку и поставить пробу в термоконтейнер, чтобы способствовать поддержанию температуры 37 градусов Цельсия и выше. Затем следует доставить в лабораторию, где сохраняется указанная выше температура и используются подогретые физиологический раствор, пластинка и реактивы.

• Иногда эритроциты анализируемой крови располагаются как «монетные столбики», и их можно принять за агглютинаты. Если добавить две капли изотонического раствора и мягко покачать планшет, красные кровяные клетки занимают правильную позицию.
• Неполная или смешанная агглютинация, встречающаяся у пациентов со второй, третьей и четвёртой группами в результате трансплантации костного мозга или в первые три месяца после переливания крови 0(I).

Обусловленные биологическими особенностями сыворотки

Ошибки, связанные с применением неполноценных стандартных эритроцитов и сывороток

Слабые сыворотки с прошедшим сроком годности или имеющие титр меньше 1:32 способны зарождать слабую и позднюю агглютинацию. Применение таких реактивов недопустимо.

Использование негодных стандартных эритроцитов или сывороток, приготовленных в нестерильных условиях и законсервированных в недостаточной степени, приводит к появлению «бактериальной» агглютинации, имеющей неспецифическую природу.

Существует множество популярных предположений о группах крови системы АВО, появившихся непосредственно после её обнаружения в разных мировых культурах. Так, например, в 30-е годы прошлого столетия в Японии и некоторых других странах получила популярность теория, связывающая группу крови с тем или иным типом личности. Подобные теории популярны и на сегодняшний день.

Есть также мнение, что человек, имеющий группу А, подвержен тяжёлому похмелью, О связана с хорошими зубами, а группа А2 - с самым высоким уровнем IQ. Но научно такие утверждения не доказаны.

Мы рассмотрели определение групп крови по системе АВО с помощью стандартных сывороток.